液氮罐冻存样品的方法与注意事项

液氮罐冻存样品的方法 ：（以独立样品pc12为例）

　　1、选择处于对数生长期的细胞。一般长约为70%-80%即可冻存，细胞数目过少或过多都不宜冻存，因为复苏后细胞生存率会降低;收集细胞24小时前换液一次。

　　2、用培养液直接将细胞消化下来，离心，1000转， 5min;

　　3、吸去上清，在离心管中加入冻存液，(冻存液配制按照60%已过滤的培养基 + 10%DMSO+ 10%胎牛血清+20%马血清配置冻存液(其中DMSO要自己配置)， 4度保存备用。)，加入冻存液后吹散计数，控制细胞悬液密度为5*106或1*107左右(不过有人建议其实不必要细胞计数，根据细胞的多少，估计一下一瓶细胞冻存几支就行了，细胞密度高一点比较好，操作时间短，对细胞损伤小。)， 细胞悬液以1ml的量分装入冻存管中(每个冻存管添加不超过1-1.5m)，在冻存管上标记冻存日期，姓名以及细胞种类。最好选择进口的冻存管;

　　4、要严密封口，慢冻过程(1.先将冻存管放入4℃冰箱，约1H。 2.接着置于-20℃冰箱，约40min-1h。 3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。 4.置于液氮罐中长期保存。) ， 注意将冻存管竖立于合适大小的不锈钢饭盒中，应避免冻存管倒立。

　　液氮罐冻存样品的注意事项：

　　1、使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。最好使用前将DMSO4度冻一下，对细胞的毒性会减少。

　　2、不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。

　　3、注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。

　　4、多余的冻存液可以4度保存备用。