液相色谱柱的保护

 　　液相色谱柱的保护

　　在液相色谱仪的使用中,保持液相色谱柱的柱效、容量和渗透特性,延长柱子的使用寿命非常重要。色谱柱用久后常出现柱压升高,柱效降低,峰形畸变, 保留时间改变等变化,如不采取适当措施,色谱柱将无法再使用,缩短色谱柱的使用寿命,本文从影响色谱柱的外界因素出发,并考虑色谱柱固定相性质的变化,讨论流动相和样品对色谱柱造成损害的因素,探讨保护方法。

　　1、样品对色谱柱的损害因素

　　杂质堵塞:样品中的微粒同样会使柱子堵塞,样品也应进行过滤处理。

　　样品组分的不可逆吸附:通常被吸附的组分有蛋白质、醣等,可以采取加装保护柱,或使用适应的溶剂反冲来处理。常用溶剂有四氢呋喃（适用于溶解有机高聚物和工业样品中的焦油）、高浓度的脲或盐酸胍溶液（使蛋白质改性而洗脱）、高离子强度的磷酸盐缓冲液（pH=7,适合反相柱和离子交换柱,可除去蛋白质和醣等）。

　　样品组分与固定相反应:这种反应对NH2柱的影响较严重,NH2易和酐、酮形成希夫（Schiff）缩合而减少活性点,使保留时间缩短,因此羰基化合物样品和流动相（如丙酮、乙酸乙酯等）不宜使用NH2柱。

　　活性点被覆盖:由于固定相吸附样品中的组成或杂质而使活性点被覆盖,在柱压升高的同时保留时间减少,将样品过滤或使用萃取分离柱（对大分子有机物如蛋白质、白细胞等）效果较好。

　　2、动相对色谱柱的损害因素

　　颗粒杂质:目前广泛使用的柱填料直径多在10um以下,微小的颗粒杂质很容易使柱子发生堵塞,因此使用的溶剂应当过滤,柱子上端接头应当装微孔过滤片以阻挡颗粒物进入柱中。

　　水溶液中的微生物:以水溶液为流动相时,应防止细菌的生长,五氯酚、叠氮化钠、辛酸等能防止细菌生长。当用水溶液或有机酸缓冲液保护柱子时,一些厌氧霉菌可能在色谱柱中滋生,堵塞固定相颗粒间的空隙。

　　pH值:对硅胶基键合相填料,水溶液pH值不可超过2-7.5这一范围,当pH>8时,硅胶会释出

　　生成絮状物堵塞柱子,且难以复原,柱效很快降低,甚至完全失效。

　　盐类析出:当在流动相缓冲液中加入和水混溶的有机溶剂时,其中的盐类溶解度下降,可析出盐类沉淀,堵塞柱子;加入粘度不同的样品溶液也可能发生类似现象。所以缓冲液中盐的浓度宜低,样品提取液的组成应和流动相匹配。

　　3、色谱柱固定相的化学变化

　　色谱柱固定相分解、活性基团变性以及键合相基团脱落会使保留时间显著变化。

　　3.1 键合相基团脱落

　　绝大多数键合相都是通过硅氧硅键（Si-O-Si）连接在硅基质上,形成带有机基团的固定相Si-O-Si-R（R为 G18H37、C8H17、CnH2n+1）。硅氧硅键可在水溶液中水解而断裂,使键合相基团脱落,对C2和NH2柱键合相基团脱落不可忽视。为减少或防止基团脱落,可增加流动相的有机溶剂量,降低离子强度和pH值,对基团已脱落的固定相,可用合适的硅烷试剂再生。

　　3.2 固定相分解或活性基团变性

　　例如氰基柱的保留时间显著缩短,但键合相中C、H、N的百分含量并无大变化,证明未发生-CN水解成-COOH反应,而是形成了衍生物。在硅上增加烷基可减少水解。

　　4、液相色谱柱的保养

　　色谱柱在使用一段时间后,常遇到柱子受污染,柱效下降的问题,采用适当的方法对色谱加以保护和再生,能够延长色谱柱的使用寿命。