液相色谱柱前衍生法测定乳及乳制品中羟脯氨酸

目的: 建立液相色谱柱前衍生法检测乳及乳制品中羟脯氨酸的方法。方法: 样品经酸水解后，羟脯氨酸与异硫氰酸苯酯在碱性条件下衍生化，经反相液相色谱分离，二极管阵列检测器254 nm 检出，外标法定量。结果: 加标回收率在93． 3% ～ 104． 6%之间，相对标准偏差为0． 97% ～ 4． 3%。结论: 方法准确、可靠，适合于乳与乳制品中是否添加动物胶原水解蛋白的鉴定。

    胶原蛋白存在于动物的皮肤、骨头、跟腱、软骨、血管和牙齿等中，约占哺乳动物总蛋白的四分之一［1］，将胶原蛋白酸水解即可制成动物水解蛋白，它是廉价的蛋白原料。某些不法厂商为了降低生产成本，在乳及乳制品中非法掺入胶原水解蛋白来冒充或替代乳蛋白，为此卫生部将皮革水解物列入第二批食品中可能违法添加的非食用物质名单［2］，曾发现浙江某乳业有限公司在含乳饮料中添加皮革水解蛋白的违法行为，并依法进行了严肃处理。
    胶原水解蛋白特有的氨基酸有羟脯氨酸( Hydroxyproline)和羟赖氨酸( Hydroxylysine) ，其中羟脯氨酸的含量较高，约占10． 0 ～ 13． 4%，而乳蛋白中不含有此成分。利用这一特性就可进行胶原水解蛋白质的鉴定，即通过对羟脯氨酸的测定来鉴定乳与乳制品中是否添加了动物胶原水解蛋白的成分［3］。
    目前羟脯氨酸的测定方法主要有比色法［4］、氨基酸自动分析仪法［5，6］、毛细管电泳法［7］、液相色谱法［8］等。比色法特异性不强、操作繁琐，精密度较差，测量结果易受多种因素影响; 氨基酸自动分析仪法虽方法成熟、可靠，在测定羟脯氨酸的同时又可测定其它16 种水解氨基酸，但分析速度慢，需要专门仪器，价格昂贵; 毛细管电泳法稳定性较差; 己有报道采用2，4－ 二硝基氯苯柱前衍生反相液相色谱法测定人肌腱中的羟脯氨酸，其衍生反应时间长。
    本法使用异硫氰酸苯酯( PITC) 作为柱前衍生剂，具有衍生反应迅速、试剂和产物稳定、分析时间短等特点。