液质联用仪在临床研究中定量分析血浆中雌二醇和睾酮

目的：采用液相色谱与三重四极杆质谱联用技术，为用于临床研究血浆中雌二醇和睾酮的定量分析，开发灵敏的 LC-MS/MS 分析方法。

简介：对用于临床研究血浆样品中雌二醇和睾酮的定量分析要求具有灵敏的分析方法。液相色谱与串联质谱联用（LC-MS/MS）技术因其是一种高灵敏度和宽选择性的分析技术，现已被广泛用于对复杂基质样品的雌二醇和睾酮的分析中，如人体血清或血浆。

实验：样品制备为制备样品，先将 10 µL 的加标溶液（最终浓度范围：0.5-10 ng/mL）和 20 µL 的内标化合物（2 ng/mL 睾酮 -13C3 和 20 ng/mL 雌二醇 -d5）加入到 400 µL 的血浆中。然后再加入 2 mL 的 MTBE，对样品溶液进行涡旋。在进行液 – 液萃取（LLE）之后 对 MTBE 层进行氮吹，氮吹后加入 200 µL 50：50 甲醇 / 水重新建立分层。取 10 µL 进样进行 LCMS/MS 分析，每个样重复进样三次。

液相色谱分析方法：采用 Thermo ScientificTM VanquishTM Flex HPLC 系统并配备 Thermo ScientificTM AccucoreTM aQ C18 极性 LC 色谱柱（100×2.1 mm，2.5 µm 粒径，P/N 17326-102130）进行色谱分离。流动相 A 和 B 分别为 0.5 mM 的氟化铵水溶液和纯甲醇溶液，溶剂分别为 Fisher ChemicalTM OptimaTM 级水和纯甲醇。柱温箱温度设为 40 ° C，总运行时间为 9 分钟（表 1）。

质谱分析方法：质谱方法采用配置加热式电喷雾离子源（HESI）的 Thermo ScientificTM TSQ AltisTM 三重四极杆质谱仪进行 分析。表 2 显示了质谱仪的离子源参数。

对雌二醇、睾酮及其同位素标记的内标化合物分析时采用选择反应监测（SRM）离子对，以提供离子比率确认（IRC）。在分时选择反应监测（t-SRM）模式下进行扫描，循环时间为 0.4 秒。表 3 显示了在本次分析中所使用的 SRM 相关参数信息。

数据分析：采用 Thermo ScientificTM TraceFinderTM 软件进行数据采集和数据处理。

结果和讨论：雌二醇和睾酮的定量下限（LLOQ）被定义为根据线性校正曲线反算所得到的校正物浓度不超过理论值的 20％、离子比率在目标物 20% 范围内，且重复进样计算所得的 %RSD 小于 20% 时的最低浓度。血浆中睾酮的 LLOQ 为 2 pg/mL - 20 fg（线性范围为：2-1000 pg/mL - 图 1），血浆中雌二醇的 LLOQ 为 20 pg/mL - 200 fg（线性范围为：20-10,000 pg/mL - 图 2）。对于所有浓度重复进样的样品而言，睾酮和雌二醇的精密度分别小于 8% 和 7%

结论：TSQ Altis 三重四极杆质谱仪为血浆中的雌二醇和睾酮的临床定量分析研究提供了卓越的灵敏度。在该篇技术文摘所描述的方法中，当采用该方法测定血浆中的睾酮和雌二醇时，定量限分别为 20 pg/mL（柱上进样 200 fg）和 2 pg/mL（柱上进样 20 fg）。