液质联用技术分析延胡索中的生物碱类成分

液质联用技术分析延胡索中的生物碱类成分

　　延胡索又称元胡，为罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuo W. T. Wang的干燥块茎，具有活血、利气、止痛之功效，临床用于治疗胸胁、脘腹疼痛、经闭痛经、产后瘀阻、跌扑肿痛等症[1]。延胡索的主要成分是生物碱，其类型分属原小檗碱型、原托品碱型、阿朴菲型、苯并菲啶型等四种异喹啉类生物碱，其中多数属原小檗碱型，少数为阿朴菲型与原托品碱型[2~5]。通过高效液相色谱法（HPLC）对其中的一种或多种生物碱进行分析，可以确定延胡索中主要组分并测定其含量[6，7]，但该法对化合物的定性能力很有限，必须在有标准对照品的情况下才能进行保留时间的比对定性和定量分析，据此所建立的延胡索质量控制方法大多只针对延胡索乙素等少数生物碱，不够全面。液质联用技术(HPLC-MS)是目前广泛应用的分析方法之一，它利用液相色谱的高效分离能力对被分析样品进行分离，再以质谱为检测器在线提供化合物的分子量信息，特别是电喷雾(ESI)软电离质谱技术的出现，为研究热不稳定和极性较大的化合物提供了简捷快速的分析方法，而多级串联质谱技术还可以提供被分析成分的结构信息。有些微量、痕量成分和无紫外吸收的化合物在用HPLC分析时很可能被忽略，而MS具有高度的灵敏性，可检测到皮克级物质，因此很容易发现这些化合物的存在[8]。目前，HPLC-ESI-MS技术已被广泛用于植物有效成分的分离及结构鉴定中[8]。此实验采用HPLC-MS联用技术分析了延胡索中的主要季铵碱类和叔铵碱类成分。 
　　1仪器与试药 
　　1.1 仪器 
　　Agilent 1100 HPLC-DAD高效液相色谱仪，Waters SunFire ODS-C18柱，英国Micromass LC/TOFMS (飞行时间质谱仪)。 
　　1.2 药材与试剂 
　　延胡索（浙江松阳产，经南京中医药大学刘汉清教授鉴定为Corydalis yanhusuo W. T. Wang 的干燥块茎）；延胡索乙素（中国药品生物制品检定所，批号0726-200510）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水。 
　　2 方法与结果 
　　2.1 样品(YHS）制备 
　　取延胡索100 g，粉碎，加1 000 ml纯净水回流提取1 h，水提液减压回收至80 ml，量取此浓缩液1 ml，加入1 ml甲醇，混匀，离心，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，制得待测样品。 
　　2.2 仪器条件 
　　2.2.1 液相色谱条件 ODS C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A为5%冰醋酸水溶液，B为乙腈；流速0.8 ml/min；采用线性梯度洗脱，梯度洗脱程序为0~10 min B为10%，10~35 min B为10%~20%，35~60 min B为20%~44%，60~85 min B为44%~80%，85~90 min B为80%~95%，90~100 min B为95%；进样量为10 μl。 
　　2.2.2 电喷雾质谱条件ESI离子源，正离子检测模式；Capillary 3 000 V；Sample cone 50 V；Extraction cone 3 V；RF lens 300 V；Desoluation Temp 110℃；Source Temp 90℃；MCP Detector 2 670 V。 
　　2.3 实验结果 
　　延胡索水提取物（YHS）的HPLC-UV图谱和HPLC-MS总离子流图如图1所示，两者的峰形和峰与峰之间的分离度都较好。根据MS所测定的[M+H]＋值，通过检索文献[2~5]，鉴定出了YHS中的11个化学成分，分别为四氢非洲防己碱、原托品碱、延胡索碱、黄连碱、延胡索乙素、非洲防己碱、四氢黄连碱、四氢小檗碱、小檗碱、巴马亭、脱氢紫堇碱，见表1。为了确证以上推论，本研究做了延胡索乙素的HPLC-MS的研究，HPLC和MS的条件即用分析YHS的条件，结果延胡索乙素在HPLC中的保留时间为27.915 min，[M+H]＋值为356，与YHS中的第5号成分相符，所以可以判断第5号成分为延胡索乙素。 
　　 
　　3 讨论 
　　电喷雾(ESI)质谱是一种“软电离”质谱，碎片离子很少。延胡索中叔、季铵生物碱电离出的分子离子峰主要以[M+H]＋的形式存在，在质谱中可得到很好的响应。由于除延胡索乙素外，其他成分没有对照品，还不能充分断定这些成分的化学结构，所以还需对这些成分的分子离子峰做二级或多级电离质谱，获取更多的碎片离子峰信息，再根据延胡索中各种生物碱的裂解规率，最终确定其化学结构。 
　　本实验利用HPLC的高分离性能和ESI-TOF/MS的强大定性功能，建立了一种快速分析延胡索水提物中各种主要生物碱的方法，为延胡索的质量控制提供了可行依据。