深圳大学Nature子刊CRISPR研究成果

　　最近，有研究报道CRISPR-Cas9系统能够靶定病毒RNA，因此这种现象提出了一个有趣的问题：Cas9是否也可能影响细胞mRNAs的翻译。7月13日，来自深圳大学第一附属医院的研究人员，在Nature子刊《Scientific Reports》上发表题为“Targeting cellular mRNAs translation by CRISPR-Cas9”的研究成果，对这个问题进行了探讨。

　　这项研究的通讯作者是深圳大学第一附属医院中心实验室副研究员黄卫人，其2009年毕业于中山大学，北京大学博士后，主要从事泌尿生殖系统疾病发生机制、肿瘤免疫细胞治疗，合成生物学肿瘤治疗、个体化诊断及治疗研究。承担国家重点基础研究计划（973）、国家高新技术发展计划（863）、国家自然科学基金、中国博士后基金、广东省自然科学基金、深圳市科技计划项目等多个项目，以第一作者或者通讯作者在Nature Communications等杂志发表SCI论文10多篇，申报国家发明ZL8项。

　　细菌II型CRISPR-Cas9系统是基础生物学和生物工程中一种新兴的多功能工具。Cas9内切酶可以通过一条向导性RNA（sgRNA），靶定和切割含有PAM的双链DNA。DNA打靶的特异性是由sgRNA-DNA碱基配对和PAM序列决定的。CRISPR-Cas9通常被重新编程为介导原核和真核系统中的基因组修饰，在工业、农业和医学上具有很好的应用。核酸酶缺陷的Cas9与转录激活因子或抑制因子融合，能在基因组范围内激活或抑制靶基因的转录。当呈现PAM的寡核苷酸作为单条DNA出现时，Cas9也可以切割单链DNA / RNA靶标。尽管在基因组编辑和基因调控领域引起了广泛的兴趣，但是这项技术还是受到脱靶效应这些问题的限制。目前，根据深度测序的结果，研究人正在开发减少这些影响的具体策略。

　　与CRISPR-Cas9诱导的 DNA干扰相反，传统的技术——包括反义RNA、核酶和RNA干扰，会在mRNA水平影响基因的表达。反义RNA通过Watson-Crick碱基配对，直接抑制互补mRNA的翻译。在设计一种重编程核酶的时候，一段引导序列被用来与靶mRNA杂交，并引导核酶的特异性裂解。小干扰RNA，如siRNA、shRNA，可通过指导RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合并降解mRNA，而介导基因沉默。基于这些观察结果——mRNA靶标可结合一段与mRNA互补的单独序列，sgRNA也有一段反义序列，科学家们想知道，sgRNA-Cas9复合物是否影响mRNA的稳定性和翻译。虽然其他CRISPR-Cas系统的sgRNA能靶定RNA，但是Cas9被认为不能切割没有单独PAM呈现寡核苷酸存在的RNA。

　　直到最近，有研究报道，sgRNA-Cas9复合物可以不依赖于PAM而与丙型肝炎病毒（HCV）的RNA结合，并抑制病毒蛋白的生产。虽然真核核糖体可以翻译细胞的mRNA和病毒RNA，但其翻译起始的机制是完全不同的。HCV RNA的翻译是由内部核糖体进入位点（IRES）介导的，而细胞mRNA的翻译是由含有多个起始因子的5′-帽结构触发的。因此，目前还不清楚的是，当不存在携带PAM的DNA时，sgRNA-Cas9复合物是否影响细胞基因的mRNA翻译。

　　在这项研究中，研究人员表明，自然和催化失活的Cas9可以抑制细胞基因的mRNA翻译，sgRNA 5’端的第一个14nt，对于这个过程是必不可少的。CRISPR-Cas9可以抑制一个意想不到的靶基因的蛋白表达，而不影响其DNA序列，也不会造成意想不到的表型变化。利用设计的RNA适配子-配体复合物——它会阻碍翻译机器，研究人员表明，障碍机制是引起这一现象的原因。这项研究表明，Cas9研究应该通过在DNA和蛋白质水平上检测基因的变化，而避免潜在的脱靶效应。