游离核酸微量DNA样本的检测

近年来，DNA分析技术广泛应用于医学、法学、环境等诸多领域，成为科学研究的一大重点。例如产前诊断及法医检测等首先进行微量DNA 提取，然后进行PCR扩增验证，也有一些研究单位会对一些古老样本进行DNA提取，同样做PCR扩增验证。它们的相同之处在于，用于分析的样本DNA含量可能极其有限，稍有遗损就可能导致无法成功检测或者没有足够的样本DNA来满足再次检测的需要。因此如何对获得的极其微量的DNA样本进行准确的定量，成为目前相关学科关注的热点之一。

然而目前微量DNA的检测方法灵敏度都不是很高，有些高端仪器虽然检测时DNA样本量很少，一般2μl左右，但是当DNA样本浓度低于10ng/μl时，其检测数据就会出现较大误差。而由此导致的PCR扩增失败，就会对DNA样本造成损失，甚至导致样本枯竭。因此开发一种经济、简便、快速的检测手段显得十分重要与迫切。北京百泰克生物技术有限公司开发的pgDetect微量核酸检测系统可以对浓度在1ng/ul以下的样本进行检测。pgDetect微量核酸检测系统的检测灵敏度为5pg/μl，采用工业级CCD摄像机，有配套定量分析软件；而DNA样本用量仅需1-2μl。

pgDetect微量核酸检测系统采用一种新型的dsDNA染料-Picogreen来进行检测，其检测灵敏度高，可检测到pg级DNA；检测范围宽，可跨越4个数量级；特异性好，基本不受ssDNA和RNA的影响，并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。目前使用Picogreen染料定量检测DNA已经广泛用于生物学检测，并被2010年版《中华人民共和国药典》选为药物残留DNA定量方法，本仪器的设计原理是通过在DNA溶液中加入Picogreen，使之发光，然后通过CCD相机捕捉光强度，zui后用pgDetect软件进行浓度分析。

其操作步骤如下：

1 准备试验样品及已知浓度的双链DNA，染料用Picogreen核酸染料.

2 标准品的浓度自行调整，一般双链DNA的终浓度在10-2000 pg/μL的条件下，可以得到好的线性关系。将标准品稀释至浓度为：1600，800，400，200，100，50，25 pg/μL及用于稀释标准品dsDNA的蒸馏水做空白对照，作为对标准品的浓度检测为例。

3 在透明管内进行操作，如可以使用PCR管或八连管等。将标准品与Picogreen核酸染料等体积混匀（如2 μL dsDNA溶液与2 μL Picogreen核酸染料混匀）此时标准品dsDNA的终浓度为800，400，200，100，50，25，12.5，0 pg/μL，同时取待测样品2μL与2μL Picogreen核酸染料混匀。试验操作完毕后，将反应管放在透射仪的蓝色显色板上，盖上暗箱,打开电源观测。此操作也可在蓝色板上铺一层透保鲜膜，将样品和染料直接点到保鲜膜上，这样透光更好，更有利于观察。

4 DNA浓度分析：打开软件，输入标准DNA的浓度，将鼠标移至待测样品，鼠标自动出现读数，该读数的zui大值为待测样本的浓度。

应用实例

北京大学的罗教授，在做古老动物分类方面的研究，经常要提取一些保存了上百年甚至更长的动物组织的DNA，如骨头，皮毛等。这些样品多是从博物馆中借的，非常珍贵。但是由于样品存放时间过长，导致其中大部分的DNA都已降解，只有少量DNA残留。这样在提取时一般只能获得很微量的DNA，提取DNA后要做PCR扩增保守序列然后再测序进行序列分析。但是由于缺乏微量DNA的检测手段，因此无法控制在PCR反应时模板DNA的加量，从而导致PCR失败，浪费了甚至比金子更珍贵的材料。在采用了百泰克生物技术有限公司的pgDetect微量核酸检测系统后，该仪器检测到37pg/μL的DNA浓度，达到了实验室对DNA浓度的需求，从而可加入比较准确的模板DNA量，为PCR反应提供了支持。