溶菌酶分离纯化及酶活力、蛋白浓度测定2

2．加样蛋白浓度低于20 mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3。

3. 在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制。过大，会使填料压缩紧密，导致流速过低，层析柱有可能堵塞而实验失败，流速过小，实验时间过长，引起酶的活性变化。对于CM Sepharose FF填料，最适流速在100cm/h以下。因此，在我们的实验中，控制流速为2mL/min。

4．冲平过程一定不能省。因为在上样过程中，还有未挂柱的蛋白未能从色谱柱中完全流出，因此需先用缓冲液对整个色谱柱进行冲平，以便使未结合或结合不紧密的杂蛋白流出，以免干扰洗脱。

五、演示

由于本实验装柱操作与实验一凝胶过滤层析的操作方法相同，所以演示略。洗脱时，梯度混合器中高盐溶液与低盐溶液的放置。依据洗脱目的进行。如果是离子交换，采用低盐上样高盐洗脱的方式，就需要将低盐放置在靠近洗脱液出口的容器中。如果是疏水层析，采取的是高盐上样低盐洗脱的方式，则将高盐溶液放置在靠近洗脱液出口的那个容器中。注意老师的演示。

六、实验报告

1．如实完整地记录实验流程、现象及结果；分析记录仪上所绘制的峰型与所分离的蛋白质纯度的关系。

2. 实验报告中必须包含原始数据以及洗脱曲线图（同组可以复印同一张图）

本实验的数据处理：根据酶的动力学特性可知，在特定的时间段，酶促反应的速度是相等的，即产物浓度随时间成线性变化。根据此特性，将所得数据在坐标纸上作图，以时间为横轴，OD595值为纵轴，将数据定位后，根据拟合直线的斜率，即为单位时间内OD值的下降值，然后再除以0.001，即可得到所取测量酶液的活力单位。除以酶液体积，即可得到酶浓度（u/mL）。

溶菌酶活力单位(U)=△OD/0.001

其中△OD为一分钟内OD值的下降值。

八、背景资料

（一）离子交换树脂

离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。网状结构的骨架部分一段很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。在网状结构的骨架上有许多可被交换的活性基团。根据活性基团的不同、离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。由于本实验采用的是阳离子交换树脂，所以将其做重点介绍。

阳离子交换树脂具有酸性基团，如葡聚糖凝胶型、琼脂糖凝胶型以及强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂等等。这种树脂的化学性质很稳定，具有耐强酸、强碱、氧化剂和还原剂的性质，因此应用非常广泛。各种阳离子交换树脂含有不同的活性基因、常见的有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)和酚基(-OH)等。根据活性基团离解出H+能力的大小不同，阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种。例如含-SO3的为强酸性阳离子交换树脂，常用R-SO3H表示(R表示树脂的骨架)，含-COOH和-OH的弱酸性阳离子交换树脂，分别用R-COOH和R-OH表示。强酸性阳离子交换树脂应用较广泛，弱酸性阳离子交换树脂的H+不易电离，所以在酸性溶液中不能应用，但它的选择性较高而且易于洗脱。本次实验采用的离子交换树脂为CM-Sepharose F.F，其中Sepharose是指琼脂糖凝胶，CM是是弱酸性活性基团—羧甲基（-CH3COOH）。

离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律。树脂对离子亲合力的大小，与离子的水合离子半径大小和带电荷的多少有关。经实验证明，在低浓度、常温下，离子交换树脂对不同离子的亲合力顺序有下列规律。对于在弱酸性阳离子交换树脂中具有相同价态离子的亲合力顺序为：Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+>Li+

根据这些原理我们利用在此条件下溶菌酶的亲和力大于H+，所以弱酸性阳离子交换树脂的活性基团在离子交换过程中可吸附溶菌酶，再采用亲和力更大的Na+进行洗脱就可得到相对纯化的溶菌酶。