按 “载体两性电解质 pH 梯度等电聚焦” 所述的方法配制 T=5%，C=3% 的等电聚焦凝胶，并进行等电聚焦。为使在第二向电泳时，样品分子有强的电荷，以便在短时间内完成第二向电泳，保证滴定曲线的精确性以及为使样品有完整的滴定曲线，一般应选择宽 pH 范围（pH 3.5~9.5 或 pH 3.5~10 )。
第一向电泳结束后，切去电极条（电极条中的盐会干扰第二向电泳 )，将此凝胶转 90°。在与加样孔平行的方向常规聚丙烯酰胺凝胶电泳用的电极条，（如进行半干电泳)，加样，然后尽快进行第二向电泳，以免 pH 梯度扩散。在第二向电泳时可以用相对比较高的电压，电泳时间便大大缩短。
由于样品中的高盐和缓冲液离子在第二向电泳时的不均匀导电性会干扰结果，故应用透析或其他方法脱盐。
加样量取决于凝胶的大小、厚度、加样孔的大小和染色方法。如用考马斯亮蓝染色，5 倍于常规的量。
第二向电泳后，用表面电极测定 pH 梯度。 展开 | 