漩涡振荡器在土壤微生物中提取总DNA并纯化应用

实验概要

从土壤微生物中提取总DNA并纯化，高质量的DNA可用于后续文库构建。

主要试剂

TENP缓冲液（50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0）

PBS缓冲液（137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4）

DNA提取缓冲液（100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0）

蛋白酶K（25 mg/mL）

溶菌酶（50 mg/mL, pH 8. 0）

20% SDS

氯仿

异戊醇

异丙醇

70%乙醇

RNAse 20 mg/mL

QIAXⅡ大片段凝胶回收试剂盒（Qiagen）

主要设备

50mL、1.5 mL离心管

摇床

高速离心机

水浴锅

电泳槽

电泳仪

MixMax漩涡振荡器

实验材料

土壤样品

实验步骤

1. 总DNA提取：

    （1） 取2 g土样，置于50mL灭菌的离心管中；

    （2） 加入10 mL TENP缓冲液（50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0）悬浮土样，200转摇床振荡10min充分混匀；

    （3） 10 000 r/min离心5 min，弃上清，重复洗涤多次至上清基本为无色；

    （4） 用5 mL PBS缓冲液（137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4）漂洗一次；

    （5） 沉淀加入13.5 mL DNA提取缓冲液（100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0），混匀后加入100 μL蛋白酶K（25 mg/mL）和200 μL溶菌酶（50 mg/mL, pH 8. 0），37℃水浴30 min，每隔10 min颠倒混匀；

    （6） 加入2 mL 20% SDS，65℃水浴2 h，每隔20 min颠倒混匀；

    （7） 8 000 r/min室温离心15 min，取上清，用等体积氯仿:异戊醇（24:1）抽提一次；

    （8） 水相中加入0.6倍体积的异丙醇，4℃沉淀一夜；

    （9） 11 000 r/min 4℃离心20 min收集DNA沉淀；

    （10） 70%乙醇漂洗两次，干燥后用100 μL ddH2O（含RNAse 20 mg/mL）溶解，转入1.5 mL离心管。

2. 总DNA纯化：

    （1） 配制0.8%琼脂糖凝胶；

    （2） 每个上样孔加入50 μL粗DNA，进行低电压长时间电泳（4℃, 25 V, 8 h）；

    （3） 电泳结束后，切下主带所在的凝胶（胶的体积尽可能小）；

QIAXⅡ大片段凝胶回收试剂盒（Qiagen）回收：加入3倍体积的Buffer QXⅠ及适量的QIAXⅡ（Glassmilk），55℃温浴10 min，每隔2 min轻轻用手指弹起沉淀（回收大片段时不要涡旋），待凝胶完全溶解，12 000 g离心1 min，弃上清；再加入500 μL Buffer QXⅠ洗涤沉淀1次以消除剩余凝胶；再用500 μL Buffer PE洗涤沉淀2次，将沉淀晾干，加入适当体积的ddH2O，离心后收集上清，琼脂糖凝胶电泳确定回收效率。