激光共焦显微镜在生物学方面的应用

　　1.　组织和细胞中荧光标记的分子和结构的检测标本制备方法主要有免疫荧光组织和细胞化学法、荧光蛋白标记分子法、荧光细胞染料标记法等。与传统的荧光显微镜相比,除了有较高的分辨率以外,一个主要的不同是激光扫描共聚焦显微镜可以利用激光点扫描成像,形成所谓的“光学切片”,进而可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像,因此可以用于观察切片和一些表面不平的标本,特别是研究具有长突起的神经元时更有使用价值。同时可以做三维图像重建和标记强度的半定量分析。
 

　　2.　定量或半定量测量Ca2+和pH等细胞内离子浓度及变化利用Fluo-3、Fura 2等荧光探针可以测量Ca2+在活细胞内的浓度及变化。一般来说,电生理记录装置加摄像技术检测细胞内离子量变化的速度相对较快,但其图像本身的价值较低,而激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像,这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。需要与电生理等技术相结合来观察离子变化与电生理学指标的相关性。
 

　　3.　荧光光漂白及恢复技术
 

　　利用高能量激光束将细胞内某一部分中选定靶区域的某种荧光淬灭,然后观察邻近相同的荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式,从而分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。一般来说,需要用荧光蛋白等标记物标记需要研究的分子,进行细胞转染表达后再做以上的实验。
 

　　4.　长时程观察细胞迁移和生长
 

　　目前激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描,而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高,只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量,从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤,因此,可以用于数小时的长时程定时扫描,记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。
 

　　5.　其他的生物学应用
 

　　用高能量激光束进行细胞损伤和损毁实验,一般要用紫外激光束进行细胞损毁;细胞间通讯研究;光解笼锁活化技术等。