激光扫描共聚焦显微镜现有技术存在的问题

  3.1 快速扫描与高分辨率之间的矛盾

      LSCM 通过单个像素扫描获取图像，点扫描特性所依赖的机械构造注定该技术是部相对缓慢的扫描仪器，对于一幅典型的 1024*1024 像素的图像，用一个常用的 2 微秒每个像素点停留时间，仅形成一幅图像的时间就长达超过 2秒。其检测范围受到生化过程反应速度的制约，对于活体观察还有一定的局限性。要提高扫描速度，通常需要牺牲图像分辨率，例如碟片共聚焦技术实现了多点成像，使成像速度进一步提高，采用的面阵图像传感器量子效率比较高，获得的图像信噪比较高，但杂散光会通过临近的针孔进入面阵探测器，从而降低图像的对比度，影响分辨率，同时由于针孔的大小不像 LSCM 一样可以调节，从而无法调控图像分辨率。

3.2 低光毒性与高分辨率之间的矛盾

      LSCM 还面临着高分辨率和低光毒性间相互矛盾难以平衡的问题，提高图像分辨率需要加强荧光信号，增强激光照射功率和时间，这种光的强度通常比一个典型的宽场荧光显微镜荧光灯强度超过 1000 倍以上，从而造成光漂白导致的光毒性，降低染料荧光寿命和样品的存活率等。而在现有的技术制约下，降低光毒性意味着减少激光照射功率和时间，不利于荧光信号的收集。目前，许多新技术如光门控、磷砷化镓混合检测器、高速扫描、光片技术、超高分辨率等，都是以降低背景信号，增强灵敏度，在使用较弱功率激光下提高信号强度为目的。但从总体上来看在降低光毒性等方面的改良还不尽完美，在实际观察中往往很难达到极限分辨率。