煮沸裂解法制备质粒DNA实验——煮沸裂解法大量制备质粒DNA

抗生素乙醇异丙醇乙酸钠STETTE溶菌酶

LB、YT 或 Terrific 培养液沸水浴

一、材料

1. 缓冲液和溶液

(1) 用于筛选质粒的抗生素

(2) 氯霉素（34 mg/ml）

(3) 乙醇

(4) 异丙醇

(5) STE

(6) STET

(7) TE ( pH 8.0 )

2. 酶和缓冲液

(1) 溶菌酶（10 mg/ml )

(2) 限制性内切核酸酶

3. 凝胶

琼脂糖凝胶

4. 培养基

LB、YT 或 Terrific 培养液

5. 离心机和转头

Beckman SW41 Ti 转头或与之相当转头；Sorvall GSA 转头或与之相当转头；Sorvall SS-34 转头或与之相当转头。

6. 特殊设备

沸水浴、本生灯、纱布（4层）。

二、方法

1. 细胞的制备

(1) 挑取转化细菌的单菌落或 0.1~1.0 ml 单菌落的培养物，接种到 30 ml 含适当抗生素的培养液（LB、YT 或 Terrific 培养液）中。

为了确保培养物通气良好：试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大 4 倍；试管不宜盖紧；培养过程中要在 250 r/min 下剧烈振摇。

(2) 在适当的温度及摇速（250 r/min ) 下培养菌液直至对数生长期晚期（OD₆₀₀约为 0.6 )。

(3) 在 2 L 的烧瓶中，将 25 ml 对数生长期晚期的菌液接种到含适当抗生素的 500 ml 的培养基（LB、YT 或 Terrific 培养液（预热到 37 ℃））中。将此培养基在 37℃ 剧烈振摇（250 r/min ) 条件下培养约 2.5 h。

最后菌液的 OD 值应约为 0.4。不同菌株之间或同一菌株含的质粒的不同，细菌的生长速度各不相同。因此为了达到理想的光密度，培养时间可略微长于或短于 2.5 h。

(4) 在培养液中添加 34 mg/ml 的氯霉素 2.5 ml，使其终浓度为 170 μg/ml。将此培养液于 37℃ 剧烈摇晃下继续以 250 r/min 培养12~16 h。

(5) 取部分菌液（1~2 ml ) 到离心管中，4℃ 贮存备用。余下的菌液于 4℃ 以 2700 g ( 对于 Sorvall GSA 转头为 4100 r/min ) 离心 15 min 收获。弃上清，倒置离心管使残余的上清流尽。

(6) 用 200 ml 冰预冷的 STE 重悬细菌，按步骤 5 重新收集并将其贮存于 -20℃。

(7) 将步骤 5 贮存的 1~2 ml 菌液按小量提取法抽提质粒。采用酶切和琼脂糖电泳分析此质粒，以确定大量培养的菌液中正确的质粒得以扩增。

设置这种对照可能看上去有点过于谨慎，然而它可以避免发生某些可能难以挽回的、浪费大量时间的错误。

(8) 将步骤 6 中冻存的细菌在室温下放置 5~10 min 使其解冻，然后用 10 ml 预冷的 STET 重悬。将重悬液转移到一个 50 ml 的 Erlenmeyer 烧瓶中。

2. 细胞的裂解

(1) 加入 1 ml 新配置的溶菌酶（10 mg/ml )。

(2) 用夹子夹住 Erlemneyer 烧瓶，在本生灯的明火上烤至液体开始沸腾。在加热的过程中不停地摇动烧瓶。

警惕：在加热过程中，不要让烧瓶的开口对着自己或实验室内的其他人。

(3) 迅速将烧瓶的下半部浸入到一大烧杯（2L ) 内的沸水中。将烧瓶在沸水中准确放置 40 s。

延长超螺旋 DNA 暴露于碱的时间会使其不可逆变性（Vinograd and Lebowitz 1996），所产生的环状卷曲 DNA 不能被限制酶切割，而且它在琼脂糖电泳中的迁移率为正常超螺旋 DNA 的两倍，难以被溴化乙锭染色。从细菌中用碱裂解法提质粒时可能会看到微量的这种 DNA。

(4) 将烧瓶在冰水中放置 5 min，使之冷却。

(5) 将烧瓶中黏稠的液体转移到超速离心管中（BeCkman SW41 管或与其相当的管），于 4℃ 以 150000 g ( 或 Beckman SW41  Ti 转头，30000 r/min ) 离心 30 min。

起初的细菌培养物长得越密，在此步就越难将该黏稠状裂解物转移到离心管中。如有必要，可用长刃剪刀将裂解物剪成大小易于操作的团块，或过 10 ml 注射器使之部分切开。从经氯霉素处理的细菌培养物中分离质粒 DNA 时，一般不会出现这一问题。

(6) 将上清尽量转移到洁净离心管中，弃去原离心管中残留的黏荷液体。

若细菌碎片未能形成紧密的团块，可以 210000 g（或 Bedtman SW41 Ti 转头，35000 r/min ) 再度离心 20 min，然后按上述方法转移上清。

(7) ( 可选）若上清中含有可见的线状基因组染色质或絮状的蛋白质沉淀，在进行下面的处理之前可用四层纱布过滤（Huang and Campbell 1993）。

3. 质粒 DNA 的回收

(1) 测量上清的体积，将上清连同 0.6 倍体积的异丙醇一起移入一只洁净离心管中，充分混匀，室温下放置 10 min。

(2) 在室温下以 12000 g ( Sorvall GSA 转头为 10000 r/min ) 离心15 min，回收沉淀下来的核酸。

若在 4℃ 下离心会使盐也沉淀下来。

(3) 小心地弃去上清，将离心管敞开盖倒置于纸巾上以除去残余的上清。在室温下用 70% 的乙醇漂洗管底及管壁，倒掉乙醇，并用连于真空管的巴斯德吸管除去附于管壁的液滴。将离心管开口倒置于纸巾上几分钟使剩余的乙醇挥发掉。此时沉淀应该仍然是湿的。

(4) 用 3 ml TE ( pH 8.0 ) 溶解核酸沉淀。

(5) 可用柱层析法、聚乙二醇沉淀法或 CsCl-溴化乙锭梯度离心法纯化粗制的质粒 DNA。

(6) 用限制酶酶切及凝胶电泳分析确证质粒的结构。