牛禽流感H5N1抗体(AIVH5N1Ab)酶联免疫分析（ELISA）

牛禽流感H5N1抗体(AIV H5N1 Ab)酶联免疫分析（ELISA）

试剂盒使用说明书

本试剂仅供研究使用       目的：本试剂盒用于检测牛血清，血浆及相关液体样本中禽流感H5N1抗体(AIV H5N1 Ab)水平，感染牛的血液学诊断。

实验原理：

  本试剂盒采用双抗原夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中牛禽流感H5N1抗体(AIV H5N1 Ab)。用纯化的牛禽流感H5N1抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中禽流感H5N1抗体相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的禽流感H5N1抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中牛禽流感H5N1抗体(AIV H5N1 Ab)的存在与否。

试剂盒组成：

样本处理及要求：

1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤：

1.         编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）

2.         加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，

3.         温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。  

4.         配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml