特殊细胞培养实验_一、二倍体细胞培养法

细胞

培养液BSS胰蛋白酶消化液

培养瓶

二倍体细胞培养方法与一般培养相同，关键在于传代，其传代程序为

1.  吸除旧培养液注入另瓶中；

2.  用BSS冲洗1 次；

3.  用0.25%胰蛋白酶消化，加入消化液量以仅覆盖住细胞层即可；作用1~5 分钟；

4.  待细胞附着松动、细胞质边缘卷起和间隔加大，便终止消化；为防止细胞丢失可不必再用BSS冲洗，直接向瓶中加入培养液（新旧培养液按2：1）新旧混合；

5.  轻轻反复吹打制成单个细胞悬液（消化不足或吹打不充分，易形成细胞团，不利于生长，应注意避免）；

6.  按一分为二比例接种培养。

一、要点

1.  采取以下措施可能利于二倍体细胞培养

（1）严格控制pH值，最好在5 %CO₂温箱中培养；

（2）换液时间不要间隔太长，且不要全部更新，尽量保留一部分旧培养液，以弃掉1/2或2/3为妥；

（3）传代期不能过长，不能让细胞长得过于密集，一旦细胞接近或刚刚连接成片，即进行传代；

（4）要选用高质量的培养基和血清，并尽量维持不变，每次传代都按一分为二的原则（细胞数量、营养液量、培养瓶的空间和面积都不得一样）进行培养；

（5）传代后如细胞不用于实验，立即低温冻存。

2.  来源于胚胎的二倍体成纤维细胞平均分裂 50 次左右即进入衰退期。

不同种类和来源的二倍体细胞生存期都不一样，但生存期皆有限。

虽然二倍体细胞具有限的生存期，却完全能满足反复使用的要求。

以成纤维细胞为例，即便从初代接种1 个细胞算起，按产生的细胞数=n×2ⁿ（n=接种细胞数）计算，它所提供的细胞也近天文数字。而在实际应用上，初代接种的细胞都几十万以上，因此一个二倍体细胞系最终提供的细胞数量近于无限的。

二、讨论

如何能保留有大量可利用的二倍体细胞？首先在初代二倍体细胞培养时，要接种多量细胞；生长成功后立即冻存做为种细胞（ Stock）。用于实验时，解冻1 分Stock，传1~3 代，按下式处理：

据上，可见二倍体细胞是可长期应用的。