特殊细胞培养实验_单细胞分离培养法

细胞

Hanks培养液胰蛋白酶

离心机滤膜

一、适应性培养基

1.  培养同源细胞（未克隆前时的同一细胞）至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24~48 小时后，吸出所有培养液；

2.  离心

3000~4000 /分，离心10 分钟后，吸取上清液；

3.  滤过

再经直径0.22 μm滤孔的滤膜过滤，低温冻存贮备用；用时取1 分适应培养基+ 2 分培养基混合使用。

二、饲细胞
 

1.  取原代培养的人或动物胚胎成纤维细胞，90 %汇合时制成细胞悬液，再按10⁵ 细胞/毫升重新接种培养；

2.  在细胞半汇合时，准备0.25 μg/ml的丝裂霉素C（MitomycineC），按2 μg/10⁶ 细胞的量加入到培养瓶中过夜；或用射线单次照射，剂量30~50 戈瑞（Gy）；

3.  细胞经上述处理后，Hanks液漂洗两次、更换培养液、再培养24 小时，胰蛋白酶消化细胞制成悬液，按5×10⁴ /ml（10⁴ 细胞/cm²）接种入新培养基中；

4.  48 小时后，即可用于细胞克隆之用。

三、底物特殊处理

1.  制备浓度为1 mg/ml的多聚右旋赖氨酸的水溶液，用以湿润培养瓶底；

2.  倒出多聚赖氨酸液，用5 mlPBS冲洗一次后，可立即使用，或存数周内使用亦可。

四、适应性底物

1.  纤维蛋白原液

纤维蛋白原液 250 mg，NaCl 800 mg，枸橼酸钠 25 mg，玻璃三蒸馏水 1000 ml，滤过法灭菌。

2.  向培养皿中先加1 ml纤维蛋白原液，然后再续加4 ml含有凝血酶原的培养液，迅速用吸管头充分混合，数分钟后便凝集形成一层清晰的胶状膜；

3.  再把细胞接种于此膜之上；也可先把细胞加入到含有凝血酶原的培养液中，在加入纤维蛋白原液后，再让细胞附在胶膜上生长。

1.  分离适应性培养基时一定要利用处于指数增生期时的细胞。因此时的细胞生长最旺盛，机能活跃，向周围环境释放促生长的物质最多，培养液中营养成分又未被耗尽，是分离制备的最好时刻。刚分离后的适应性培养基中可能含有少量细胞，一定要通过离心和滤过排除干净，以免形成假克隆。

一、提高克隆形成率的措施

细胞经过稀释后，在低密度状态下培养时，克隆形成率明显下降，即克隆形成率与细胞的密度成正比。对无限细胞系来说尚无严重影响，它们的克隆形成率一般很少降到10 %以下。但初代培养细胞和有限细胞系的克隆形成率则很低，仅有0.5 %~5 %，甚至为零。因此必须提高细胞克隆形成率才易克隆成功，为此常采取以下一些措施：

1.  培养基

为提高细胞克隆形成率，选择适当的培养基是非常重要的环节，现知以下一些培养基用作克隆时效果可能较好。

以上培养基都是个别研究者选用的，难免有一定的局限性。事实上分散于各实验室的同一种细胞，经过长期培养后，难免发生一些适应性变化。因此同一种培养基也不一定能适用于不同条件下的同类细胞。