生化培养箱中的大肠杆菌的检测方法

大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。

　　食品中大肠菌群数系以100mL（g）检样内大肠菌群zui可能数（MPN）表示。

　　1 设备和材料1.1 生化培养箱：恒定温度36±1℃。

　　1.2 冰箱：0～4℃。

　　1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。

　　1.4 天平。

　　1.5 显微镜。

　　1.6 均质器或乳钵。

　　1.7 平皿：直径为90mm。

　　1.8 试管。

　　1.9 吸管。

　　1.10 广口瓶或三角烧瓶：容量为500mL。

　　1.11 玻璃珠：直径约5mm。

　　1.12 载玻片。

　　1.13 酒精灯。

　　1.14 试管架。

　　2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管：按GB 4789.28中4.9规定。

　　2.2 伊红美蓝琼脂平板：按GB 4789.28中4.25规定。

　　2.3 乳糖发酵管：按GB 4789.28中4.10规定。

　　2.4 EC 肉汤：按GB 4789.28中4.11规定。

　　2.5 磷酸盐缓冲稀释液：按GB 4789.28中3.22规定。

　　2.6 生理盐水。

　　2.7 革兰氏染色液：按GB 4789.28中2.2规定。

　　3 操作步骤3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL（或g）放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内予置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样用均质器，以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。

　　3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1:100的稀释液。

　　3.1.3 另取1mL灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管。

　　3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种3管。

　　3.2 乳糖发酵试验将待检样品接种于乳糖 胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±1℃ 温箱内，培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

　　3.3 分离培养将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃ 温箱内，培养18-24h,然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。

　　3.4 证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置 36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

　　3.5 报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。

　　4 粪大肠菌群（faecal coliform）4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物（见3.2条）转种于EC肉汤管内，置44.5±0.2℃水浴箱内（水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面），培养24±2h,经培养后，如所有EC肉汤管均不产气，则可报告为阴性；如有产气者，则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上，置 培养18-24h,凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。

　　4.2 结果报告根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）粪大肠菌群的MPN值。