生物制药中蛋白质团聚物测量技术概述（一）

随着生物分子在许多制药公司药物开发途径中所占据的比例越来越大，人们越来越关心相关开发、生产与监管方面难题的解决。由于药物的潜在免疫原性是生产商和监管者都十分关心的要素，因此如何定义生物药品的纯度与效力要比那些小分子药物复杂得多。这反过来突显了业界对高质量分析工具的迫切需要——希望它们能有助于全面表征出生物药物颗粒和团聚物，同时对药物内在颗粒与污染物的理化特性表征也越来越重视。

测量的用处何在？

药物分子从发现走向早期配方是十分关键的一个步骤。分子的理化特性是药物配方与给药的决定因素；药物分子的理化特性确定得越早，就能获得越大的经济效益——无论是为了确定上述步骤成功的可能性，还是尽早避免可能的失败。就这一点而言，比较理想的是能够在非常少量的样品上进行一系列非破坏性试验，并且把更多的精力放在改善可能用到的测试过程中。

从药物分子理化特性表征到药物开发过程直至最终的成品测试，发现和检测蛋白质团聚物，是药物开发最重要的步骤，因为理解药物分子这方面的行为对于药物产品的配制、稳定性和安全性来说都是至关重要的。蛋白质结构是通过范德华力、氢键、二硫键和疏水作用的结合来保持的，环境条件的改变可能会影响其中的一些或者全部相互作用力——其结果可能会引发团聚物非正常的折叠或者对于溶解性造成负面影响。在此过程中，蛋白质的活性常常会消失，也有可能很多团聚物会发展出免疫原性，从而对最终治疗药物产品的有效性和安全性造成显著影响。

当前的监管预期是，对团聚物和大小范围在“0.2- 2”微米级别1的不溶性微粒进行表征。大小超过几微米的团聚物可以用视觉方法来进行表征。小于这个尺寸的，可以采用动态光散射(DLS) 法和体积排除色谱 (SEC) 法等成熟的分析技术对蛋白质凝聚物进行表征。图1列出了上述方法所采用的技术和测量范围。共振质量测量法 (RMM)是最新发展的技术现在也被用来检测和统计50 nm到5μm这一至关重要尺寸范围内的不溶性微粒，并对它们的浮力质量、净质量和粒径大小进行可靠的测量。共振质量测量法为不溶性微粒和亚微米级凝聚物提供了测量窗口。

动态光散射法的使用

动态光散射法测量迅速，属于非侵入性的测量方式，特别适合在药物试剂开发的早期阶段筛选蛋白质。该技术测量了布朗运动下的蛋白质所产生的散射光强度波动，并将结果转化为尺寸与尺寸分布数据。这种技术最大的优点之一是能够在最早的阶段对蛋白质团聚物进行检测，从而确定生成或者阻止蛋白质形成团聚物的条件。

蛋白质分析过程应该选择理想的动态光散射（DLS）技术。当溶液中蛋白质尺寸与散射光波长相比非常小时，散射光的强度不再取决于角度，也就是说从任何角度进行测量都会得出相同的结果。然而随着蛋白质尺寸增大并超过≈λ/ 10时，向前的散射光强度开始增加，此时，从合适的角度对数据进行收集就变得十分重要。例如，采用配有背向散射检测技术的仪器，通过测量前后两个方向 (见下列数据)的散射光强可以对蛋白质团聚过程进行有效的监控。

应用体积排除色谱法

体积排除色谱法 (SEC)，顾名思义，是利用分子在流体力学尺寸上的差异分离溶解的高分子。通常在生物科学实验室会采用这种方法来表征纯化和重组的蛋白质。当使用SEC作为分析工具时，其得到的信息量和有效性取决于和色谱连接的检测技术。

单检测SEC采用紫外 (UV) 检测仪来检测浓度，依然是测试所有蛋白质团聚物的传统手段，但是功能更为强大的多检测系统在这个应用领域越来越受到人们的青睐，因为它们可以提供互补的信息和对检测结果综合解释。例如，结合了示差折光检测器(RI) 、紫外检测器、光散射检测器和粘度检测器的系统可以对蛋白质样品进行全面表征，提供分子量数据以及详细的结构变化和特征，同时避免了色谱柱校准的需要。

图3显示了GPC /SEC色谱仪对牛血清蛋白样本的检测，上面显示了由RI和光散射检测器组成的系统所获得的响应。红色为RI信号，在大约25毫升时反应比较明显，根据相应光散射强度数据 (绿色) 计算得到的分子量，可以确定是单体。较早出现的两个流出峰，根据分子量可以确定为二聚体和三聚体。最早出现的峰值处所对应的大量光散射信号表明，这些是团聚物。如果仅仅依靠单个RI/UV检测器系统是对于所有组成进行准确的定性定量的检测是不可能完成的。