例(6)用Cs2SO4 及尿素作梯度材料分离生物大分子
样品:初步离心后的蛋白-核酸混合液梯度液:
3.00g Cs2SO4
2.5ml 8M 尿素(经过混合床去离子处理的)
50μl 1.0M Tris-HCl(PH7.4)
25μl 0.2M EDTA(PH7.4)
1.25ml 样品的水溶液
以上各项充分混合后注入5ml PA 快速密封管
固定角式转头 130,000xg,5℃ 离心64 小时,慢减速
或600,000xg,5℃ 离心14 小时,慢减速
甩平转头 400,000xg,5℃ 离心22 小时
·结果分析:其中蛋白用35S 同位素标记
RNA,DNA 用32P 同位素标记
离心后样品分布收集成30 管,在液闪仪上测定,绘出从离心管表面—>管底的容量为横坐标,同位素32P, 35S 计数为纵坐标的曲线图,很明显可以找到蛋白,DNA,RNA 的峰位置。
例(7)用RbCl 梯度分离不同密度的蛋白质:
配置:样品:经过初步分离的蛋白质 50μg-200μg
1.75g RbCl
0.5ml 1M Tris-acetate (PH7.1)
水容量=3.25ml
(充分混合后注入离心管)
固定角式转头,5ml PA 管
250,000xg,5℃ 65 小时,慢减速
或 600,000xg,5℃ 27 小时,慢减速
甩平转头 400,000xg,5℃ 42 小时
离心后沿离心管长度方向分部收集成50 管。
用分光光度计分别测各管O.D.值,以管容量为横坐标,O.D.值为纵坐标绘制曲线, 可以找到各种蛋白的峰位置。
例(8)用CsCl-Cs2SO4 梯度分离RNA 片断:
配置:
1.9ml 饱和的CsCl 液
1.7ml 饱和的Cs2SO4 液
1.5ml RNA样品(5-10μg 溶于0.1M Tris-HCl(PH7.5)及10mM EDTA)
0.25ml DMSO(5%)
充分混合后注入5ml PA 离心管
离心二次: 第一次170,000xg,25℃, 18 小时(固定角式转头)
第二次100,000xg, 25℃, 48 小时(固定角式转头)离心后沿离心管长度方向收集30-50 管,用比重计测密度。
(因为是CsCl 与Cs2SO4 混合梯度,不能用光折射仪测RI)。
结果:横坐标为管容量,纵坐标为密度绘制曲线,可以找到不同密度RNA 所在位置。
例(9)用NaBr 梯度分离血清脂蛋白:
(i) 溶液配置:
干燥的NaBr 晶体,在210℃恒温箱中过夜,分别配置下列不同密度的NaBr 液体:
1.006克/毫升(9 克/升)
1.019克/毫升(27 克/升)
1.063克/毫升(95 克/升)
1.210克/毫升(283.4 克/升)
1.386克/毫升(524.8 克/升)
所有的溶液均含0.05% EDTA(PH7.0),溶液经过滤后储存在暗褐色瓶中,4℃保存。
(ii) 实验过程
(1) 人全血1,000xg 离心10 分钟去除各种血细胞,上清液为血清。
(2) 0.2ml 血清与0.8ml,1.386 克/毫升的NaBr 液混合。
(3) 将已稀释的血清样品1ml 置于14mlPA 管底部,然后往上依次铺设梯度液
3.2ml,1.21g/ml NaBr 液
3.8ml,1.063g/ml NaBr 液
3.3ml,1.016g/ml NaBr 液
1.2ml,1.006g/ml NaBr 液
(4)甩平转头,260,000xg,14℃,24 小时
各种密度的脂蛋白从管底浮向它们自己的等密度区形成了纯的各种密度脂蛋白区带。而离心管底部保留着各种血清蛋白。
(5) 用上排法从离心管中抽出各层液体,由蠕动泵输送经过带流动池的紫外可见分光光度计经检测光密度(O.D.)值后用部分收集器收集于0.5ml eppendorf 管中。
(6) 从分光光度计的O.D.曲线,可以从0.5ml 离心管中给各种不同密度血清脂蛋白定位。
(7) 结果:
血清脂蛋白代号及名称 | 收集管编号 | 从14ml 离心管上液面向下计算的容积(ml) |
VLDL(极低密度脂蛋白) | 1-2 | 0.5-1.0 |
IDL(较低密度脂蛋白) | 3-4 | 1.5-2.0 |
LDL(低密度脂蛋白) | 5-9 | 2.5-4.5 |
HDL1(高密度脂蛋白) | 10-12 | 5.0-6.0 |
HDL2(较高密度脂蛋白) | 13-17 | 6.5-8.5 |
HDL3(极高密度脂蛋白) | 18-20 | 9.0-10.0 |
(8)也可以用NaBr 的连续梯度(从1.003 克/毫升-1.200 克/毫升)来进行血清脂蛋白分离,甩平转头,95,000xg,4℃,2 小时,也可以得到类似结果。
参考文献:
(1)D.Rickwood 等
“ Centrifugal methods for characterizing macromolecules and their interactions” Oxford.Uni.Press 1992
(2) B.D.Hames 等
“Gel electrophoresis of proteins : a practical approach”
IRL Press. Oxford 1990
(3) C.J.Howe 等
“Gel electrophoresis of nucleic acids: a practical approach”
IRL Press.Oxford 1990
(4)E.S.Ward 等
“Nucleic acid Sequencing: a practical approach”
IRL Press. Oxford 1989
(5)J.B.C.Findlay 等
“Protein Sequencing: a practical approach ”
IRL Press. Oxford 1989
(6)余兴明:“质粒DNA 的超速离心分离”
“生命的化学”1994.1
(7)余兴明:“血清脂蛋白的离心分离”
“生命的化学”1997.3
(8)余兴明:“密度梯度离心基础”
hea100 网站 2000.6
(9)M.Dobrota “Conditions for density Gradient Separations”
Oxford Uni.Press.1992
同学们都在知名期刊发表了论文,自己的研究却毫无进展;无论实验如何调整,都像在原地踏步;离提交博士论文进度报告只剩1个月,但连续开展了近1年的实验却宣告失败……接连的失败,让ShreyaPramanik......
同学们都在知名期刊发表了论文,自己的研究却毫无进展;无论实验如何调整,都像在原地踏步;离提交博士论文进度报告只剩1个月,但连续开展了近1年的实验却宣告失败……接连的失败,让ShreyaPramanik......
南京大学物理学院教授杜灵杰团队利用极端条件下的偏振光散射技术,在砷化镓量子阱中对分数量子霍尔效应的集体激发进行了测量,进而在全球首次观察到引力子激发(引力子模)——引力子在凝聚态物质中的新奇准粒子。3......
分析仪器是一种用来测量、分析和监测物质性质和组成的工具。它们通常由硬件设备和软件程序组成,可以用来检测和分析各种物理、化学和生物学参数。常见的分析仪器包括光谱仪、质谱仪、色谱仪、电化学分析仪、生物分析......
近日钟南山团队发布的一项国际多中心研究表明,连花清瘟胶囊对轻至中度新冠肺炎(COVID-19)患者的症状恢复显示出显著效果。该研究在中国、泰国、菲律宾和越南的17个研究点进行,共纳入410名接受连花清......
10月28日,石家庄以岭健康城举行了一场重要的启动会——络病理论创新转化全国重点实验室启动会暨第一届学术委员会第一次会议。此次会议标志着络病理论创新转化全国重点实验室的正式启动,并宣布中国工程院院士吴......
据中国载人航天工程办公室消息,北京时间2023年10月26日11时14分,搭载神舟十七号载人飞船的长征二号F遥十七运载火箭在酒泉卫星发射中心点火发射,约10分钟后,神舟十七号载人飞船与火箭成功分离,进......
7月22日晚间,航天英雄、中国首飞航天员、中国载人航天工程副总设计师杨利伟,英雄航天员、神舟十三号航天员叶光富,400余名北京市中小学生代表和科技工作者代表齐聚中国科技馆,共同参加由中国科技馆联合中国......
......
当今世界正经历百年未有之大变局,国内外形势发生深刻复杂变化,围绕科技制高点的竞争空前激烈,我国关键核心技术“卡脖子”问题依然存在,创新驱动发展和高质量发展任重道远。特别是基础研究投入不足,科技创新资源......