生物氧化—乳酸脱氢酶递氢作用实验

实验概要

本实验介绍了生物氧化—乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的递氢作用，有助于学习掌握其实验原理和操作方法等。

实验原理

乳酸脱氢酶（lactate   dehydrogenase，LDH）普遍存在于全身各组织细胞，尤以肌肉细胞为甚。在有辅酶Ⅰ存在时，乳酸脱氢酶可使乳酸脱氢转变成丙酮酸，其氢可经由辅酶Ⅰ、黄素酶传递给甲烯蓝，使之转变为甲烯白。由此产生的颜色变化即可认证乳酸脱氢酶的上述催化作用。

乳酸脱氢酶催化乳酸与丙酮酸之间的可逆反应，本实验采用KCN与丙酮酸反应生成丙酮酸氰醇而取走反应体系中的丙酮酸，于是反应便不断朝着乳酸脱氢成丙酮酸的方向进行。

主要试剂

1. 0.5%KCN

2. 2%乳酸钠

3. 0.04%甲烯蓝

4. 0.9%NaCl

5. 石蜡油

主要设备

1. 手术剪

2. 电炉

3. 烧杯

4. 乳钵

5. 漏斗

6. 纱布

7. 活性炭

8. 试管和刻度试管

实验材料

实验家兔

实验步骤

1.   辅酶溶液的制备：先将盛有6ml水的试管置于沸水浴中，约5分钟后，取实验用小白兔一只，静脉注射空气致死，迅速剪下腿部肌肉8-10克，去除筋膜，剪成碎块，立即投放于沸水浴中的热水试管里，煮沸4-5分钟以破坏肌肉中酶的活性，这一步应尽量迅速。之后，取出试管，将内容物倒入乳钵中，研成细浆，两层纱布过滤，收集滤液（内含备用的辅酶Ⅰ）。

2.  乳酸脱氢酶溶液的制备：再取小白兔腿部肌肉8-10克，置于乳钵中，加沙少许，加0.9%NaCl  8ml一同研成细浆，收集滤液（内含乳酸脱氢酶及黄素酶等）。滤液中加活性炭约0.5mg，混匀，放置15分钟，并时时摇动，以吸去辅酶。最后，滤去活性炭，留取滤液备用。

3. 取试管4支，标上号码，依次加入下列各溶液。

将各管混匀，各加石蜡油10滴，覆盖溶液表面，时时观察各管的颜色变化。

注意事项

1. 氰化钾有剧毒，切不可用口吸取试剂，以免不慎入口中毒。

2. 在冬季，4只试管应插入40-50℃水浴中，以加快还原反应。

3. 肌肉组织也含有乳酸，因此上文所制的辅酶溶液和乳酸脱氢酶溶液中都含有若干的乳酸，第3管也能褪色，但褪色速率是较慢的。操作中，应严密注意观察第2.第3管颜色变化的快慢。实验中，甲烯蓝及乳酸钠的量应为最小量，如果太多，则颜色变化就难区别了。