生物素酰化探针的制备实验

DNA

DNA聚合酶 dNTP 2-疏基乙醇 生物素 甘油 NaCl EDTA SDS 无水乙醇

注射器 电泳仪 离心机 培养箱

1.  混合以下物质于100 μl 反应体积：

（1）10 μl  10×大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ缓冲液

（2）10 μl  0.5 mmol/l 3dNTP混合液

（3）10 μl  0.5 mmol/l 生物素-11-dNTP贮存液

（4）10 μl  0.5 mmol/l 2-ME

（5）2 μg  DNA

（6）20 U  大肠杆菌聚合酶Ⅰ

（7）DNA酶Ⅰ贮存液，用钱用冷水稀释1000倍

（8）加水到100 μl，15℃温育2~2.5 h。

2.  取6 μl 反应液，煮沸3 min 置于冰浴2 min。

3.  加样于琼脂糖凝胶，同时带对照分子量标准，在15 V/cm 电压降下电泳。

4.  消化的DNA大小介于100~500 bp 之间，接步骤5继续，若大小在500~1 000核苷酸之间（或更大）加入第二份DNA酶Ⅰ继续温育。

5.  加入2 μl，0.5 mol/l pH8.0的EDTA和1 μl 10%SDS，68℃加热10 min 终止反应和灭活DNA酶Ⅰ。

6.  在1 ml 注射器中准备如Sephadex G-50离心柱，用2 ml 无水乙醇清洗注射器和硅化的玻璃棉。

7.  接着用4 ml H₂O冲洗，将G-50介质装入注射器至刻度，用100 μl SDS柱缓冲液冼3~4次，上样。

8.  分离生物素酰化的探针。探针浓度应约为20 ng/μl ，探针可直接使用，也可在-20℃保存数年而不丧失活性。

9.  用比色法估计生物素酰化反应的程度和探针的质量或进行化学发光检测。