目前用荧光探针作为检测信号的仪器,主要是考虑荧光标记所要检测的DNA的效率,以及荧光探针本身的发光效率和光谱特性。
PCR过程中的DNA标记
1.末端标记:在引物上标记有荧光探针,在DNA扩增过程时,使新形成的DNA链末端带有荧光探针。
2 .随机插入:选择四种缄机基,使其中一种或几种挂有荧光探针,在PCR过程中,带有荧光探针的碱基和不带荧光探针的碱基,同时参与DNA链的形成。由于带有荧光探针的碱基,可能影响PCR的产物,因此,需要调整荧光标记的碱基与未标记的碱基比率,以使得PCR产量和带有荧光探针的碱基在DNA的插入率达到一个平衡的水平,使杂交信号最强。
RNA转录过程的荧光探针标记
某一种碱基标记有荧光,但要求该种碱基标记与非标记按一定比率混合,以达到最佳转录效果。
探针的选择
主要考虑以下几个因素:
荧光探针的激发和发射频谱;
荧光探针的发光效率;
荧光探针对PCR或逆转录效率的影响;
不同荧光探针的发射光谱是否有重叠。
常用的荧光探针:FITC,CY-3,ALEAX488,CY-5,ALEAX564