| 实验步骤 |
材料
缓冲液和溶液
贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
贮存液稀释至适当浓度。
考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
参见附录 8。
1XSDS 凝胶加样缓冲液
不含 DTT 的 1xSDS 凝胶加样缓冲液室温保存，1mol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。
L-色氨酸（10 mg/ml)
凝胶
SDS-聚丙烯酰胺凝胶（10%)
用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录 8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或 cDNA 片段
培养基
LB 琼脂平板
LB 培养基
根据所用载体在培养基中加入不同的抗生素。
加热到 65°C 的 LB 培养基
备选，参见步骤 13。
M9 基本培养基
灭菌后补加 0.5%(m/V) 葡葡糖，0.2%(m/V) 酪蛋白酸水解物和所需抗生素，用于色氨酸诱导的表达载体。
离心机和转头
SorvallGSA 转头或相当的转头
特别配备
沸水浴
设定为 30°C 和 40°C 的振荡培养器
只有使用λ噬菌体 cI 基因的温度敏感型等位基因时才需要。
补充试剂
本方案步骤 1 需要第 8 章方案 7 中所列试剂。
本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。
载体和细菌菌株
带有λ噬菌体 cI 基因的 cIts857 等位基因或野生型等位基因的大肠杆菌菌株在 M5219 菌珠中是热诱导的 clts857 等位基因，在 GI724 菌珠 (ATCC55151cI 基因）中是色氨酸诱导的野生型 cI 基因。
PL 表达载体（如 pHUB,pPLc,pKC30,pASl,pCQV2,pAL-781 和 pTrxFus)
阳性对照质粒（表达已知大小融合蛋白的 PL 表达载体）
方法
含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建
1.PCR 修饰（第 8 章方案 7) 或限制性内切酶消化分离 DNA 片段，片段 5'端和 3'端带有与 PL 表达载体对应的限制酶位点。
必要时可在 cDNA/基因的 ATG 上游置入强的核糖体结合位点。
为确定扩增反应没有引入错误突变，应对 PCR 产物进行序列分析。
2. 靶 cDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接（第 1 章方案 17 或 19)。
3.
连接产物转化含有 cIts857 等位基因或野生型 cI 基因的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含相应选择抗生素的 LB 平板（通常为
50ug/ml 的氨苄青霉素），于 30°C(含有cIts857 等位基因）或 37°C(含有色氨酸诱导的野生型 cI 基因）过夜培养。
空的表达质粒转化相同的大肠杆菌菌株作阴性对照。
4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体（请参见第 12 章方案 3)。
诱导靶蛋白表达的优化
许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担，导致形成包涵体。
5. 通过提髙温度或加入色氨酸，下调 cI 阻抑蛋白，诱导靶蛋白表达，筛选最佳表达条件。
影响诱导表达的因素请参见方案 1 步骤 8 的注解。
对于溫度诱导系统
a. 对照菌和重组菌分别挑取 1~2 个菌落，接入 1 ml 含所需抗生素的 LB 培养液，30°C 培养过夜。
编码己知大小蛋白的表达载体作阳性对照。
b. 取 50ul 接入 10 ml 含抗生素的 LB 培养液，在 50 ml 摇瓶中于 30°C 培养至对数中期（A550=0.5?1.0)。
c. 吸出 lml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤 6 和 7 所述进行处理。
d. 调整温度至 40°C, 诱导剩余培养物。继续步骤 6。
尽管在本书其他章节中采用 42~45°C 灭活λ噬菌体 cIts857 阻抑物，但此处采用40°C 以便减少热激蛋白的诱导并使细菌能够继续生长。
对于色氨酸诱导系统
a. 含空载体和重组表达载体的大肠杆菌（带有 cI 野生型等位基因）分别挑取 1~2个菌落，接入 1ml 补充 M9 培养液，37°C 培养过夜。
编码已知大小蛋白的表达载体作阳性对照。
b. 取 50ul 接入 10 ml 补充 M9 培养液，在 50 ml 摇瓶中于 37°C 培养至对数中期(A550=0.5~1.0)。
c. 吸出 1 ml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中，按下面步骤 6 和 7 所述进行处理。
d. 剩余培养物中加入色氨酸至终浓度 100ug/ml,37°C 继续培养。
6. 诱导不同时间（如 1、2、4 和 6 h) 后取 1ml 样品放于微量离心管中，测定A550, 室温高速离心 1 min。
7. 沉淀悬于 100ul 1XSDS 凝胶加样缓冲液，100°C 加热 3 min, 室温高速离心lmin，冰上放置，待全部样品处理完后上样。
8. 样品加热至室温，取 40ug 或相当于 0.15 OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。
9.8~15V/cm 电泳，至溴酚兰迁移到分离胶底部。
10. 考马斯亮蓝染色或银染，或免疫印迹，观察表达产物条带（见附录 8)。
未转化的大肠杆菌细胞和转化了空载体的细胞，蛋白质带形应该没有区别。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带。
大量表达靶蛋白
11. 挑取一个重组大肠杆菌菌落接入 50 ml 含抗生素的 LB 培养液或补充 M9 培养液,
在 250 ml 摇瓶中于 30°C 或 37°C 过夜培养。
12. 取 50 ml 过夜培养物接入 450 ml 含抗生素的 LB 培养液或补充 M9 培养液，在 2L 摇瓶中于 30°C 或 37°C 振荡培养至对数中期（A550=0.5~1.0), 按步骤 13 或 14 进行诱导。
13.
加入 500 ml 加热至 65°C 的 13 培养基，诱导带 cIts857
等位基因的大肠杆菌。40°C培养预试验确定的最佳时间。或者于室温以 12000 g(8600r/min Sorvall 转头）离心 5 min
收集细胞，沉淀重悬于 500 ml40°C 的LB 培养基，40°C 继续培养预试验确定的最佳时间。
14. 加入色氨酸至终浓度100ug/ml, 诱导带 cI 等位基因的大肠杆菌。37°C 继续培养预试验确定的最佳时间。
15. 诱导适当时间后，于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头）离心 15 min 收集细胞，继续后面的纯化方案：
• 如果表达的是 GST 融合蛋白，继续方案 5
• 如果表达的是麦芽糖结合蛋白融合蛋白，继续方案 6
• 如果表达产物带有组氨酸标签，继续方案 7
展开 |
