用克隆环分离细胞克隆

胰蛋白酶

硅油

克隆培养环 巴氏吸管 生长培养基 多孔板 无菌镊 移液器 粗头笔

1. 观察细胞克隆，用毡制粗头笔或 Nikon 标记笔（毡制粗头笔或者最好用 Nikon 标记笔或物镜标记笔，可插入显微镜物镜换镜转盘的位置，对所选的克隆集落划上标记）在培养皿底面对要分离的集落做标记。

2. 撤去培养基，用 D-PBS 轻轻冲洗细胞克隆。

3. 用无菌镊夹取一个克隆培养环（放在培养皿中干热或高温高压灭菌），蘸取硅油（于玻璃培养皿中160°C 干热灭菌 1 h , 或121°C 高压灭菌 15 min），硅油面朝下，压放在培养皿上，使硅油均匀分布在克隆培养环底面。

4. 将环圈套于所需集落上。

5. 在同一培养皿重复步骤 4、5 , 圈套  2~3 个其他所需集落。

6. 加足量的 0.25 % 胰蛋白酶（D-PBS 配制的 0. 25 % 胰蛋白酶）充满环内（0.1~0. 4 ml，取决于环内径的大小）。

7. 保留 20s，后弃去。

8. 盖上培养皿，37°C 下孵育 15 min 。

9. 每个环中加 0.1~0. 4 ml 的培养基。

10. 依次对每个克隆用吸管吹吸分散细胞，并将细胞悬液分别移入 24 孔板的一孔或竖直放置的 25 cm² 的培养瓶内，每个细胞克隆都分别使用独自的吸管或枪头（黄色枪头或弯头吸管和带钝头的巴氏吸管）。

11. 再用 0.1~0.4 ml 的培养基冲洗克隆环，再将这些培养基分别移入相应的培养孔或培养瓶中。

12. 将培养孔中的培养基加至 1 ml，盖好，继续培养。如果用的是培养瓶，就在每个瓶中加 1 ml 的培养基，竖直放置培养。

13. 当克隆细胞长满培养孔时，移至 25 cm² 培养瓶内，加 5 ml 培养基，常规培养。如果采用的是直立培养瓶法，当瓶底长满细胞后，撤去培养基，胰蛋白酶消化，加 5 ml 培养基，平放培养瓶继续培养。

培养皿暴露过长时间会变干， 所以要限制分离的克隆数量或在每步操作之间盖上培养皿。