| 实验方法原理 | 将集落在瓷制克隆环、玻璃环、PTFE 环或者不锈钢环中用胰蛋由酶消化后移至24 孔或12 孔板中的一个孔或者直接种于 25 cm2 的培养瓶内。 |
|---|---|
| 实验材料 | 胰蛋白酶 |
| 试剂、试剂盒 | 硅油 |
| 仪器、耗材 | 克隆培养环 巴氏吸管 生长培养基 多孔板 无菌镊 移液器 粗头笔 |
| 实验步骤 | 1. 观察细胞克隆，用毡制粗头笔或 Nikon 标记笔（毡制粗头笔或者最好用
Nikon 标记笔或物镜标记笔，可插入显微镜物镜换镜转盘的位置，对所选的克隆集落划上标记）在培养皿底面对要分离的集落做标记。 2. 撤去培养基，用 D-PBS 轻轻冲洗细胞克隆。 3. 用无菌镊夹取一个克隆培养环（放在培养皿中干热或高温高压灭菌），蘸取硅油（于玻璃培养皿中160°C 干热灭菌 1 h , 或121°C 高压灭菌 15 min），硅油面朝下，压放在培养皿上，使硅油均匀分布在克隆培养环底面。 4. 将环圈套于所需集落上。 5. 在同一培养皿重复步骤 4、5 , 圈套 2~3 个其他所需集落。 6. 加足量的 0.25 % 胰蛋白酶（D-PBS 配制的 0. 25 % 胰蛋白酶）充满环内（0.1~0. 4 ml，取决于环内径的大小）。 7. 保留 20s，后弃去。 8. 盖上培养皿，37°C 下孵育 15 min 。 9. 每个环中加 0.1~0. 4 ml 的培养基。 10. 依次对每个克隆用吸管吹吸分散细胞，并将细胞悬液分别移入 24 孔板的一孔或竖直放置的 25 cm2 的培养瓶内，每个细胞克隆都分别使用独自的吸管或枪头（黄色枪头或弯头吸管和带钝头的巴氏吸管）。 11. 再用 0.1~0.4 ml 的培养基冲洗克隆环，再将这些培养基分别移入相应的培养孔或培养瓶中。 12. 将培养孔中的培养基加至 1 ml，盖好，继续培养。如果用的是培养瓶，就在每个瓶中加 1 ml 的培养基，竖直放置培养。 13. 当克隆细胞长满培养孔时，移至 25 cm2 培养瓶内，加 5 ml 培养基，常规培养。如果采用的是直立培养瓶法，当瓶底长满细胞后，撤去培养基，胰蛋白酶消化，加 5 ml 培养基，平放培养瓶继续培养。  |
| 注意事项 | 培养皿暴露过长时间会变干， 所以要限制分离的克隆数量或在每步操作之间盖上培养皿。 |
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