用制备凝胶电泳纯化寡核苷酸实验

丙烯酰胺 双丙烯酰胺 尿素 过硫酸铵 N N N' N'-四甲基乙二胺 合成的互补寡核苷酸 仲丁醇（2-丁醇) 二乙醚 NaOAc MgCl2  乙醇 TBE  甲酰胺加样缓冲液 TE

SpeedVac 旋转浓缩仪

材料与设备

丙烯酰胺

双丙烯酰胺

尿素

过硫酸铵（10%;w/v)

N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)

合成的互补寡核苷酸（含待分离序列特异性 DNA 结合蛋白的识别序列)

仲丁醇（2-丁醇)

二乙醚

NaOAc(3mol/L)

MgCl₂(1mol/L)

乙醇（100% 和 75%;v/v)

SpeedVac 旋转浓缩仪（SavantInstruments,Inc.)

试剂

TBE(10x)

甲酰胺加样缓冲液

TE

(配方，见“试剂的配制”，P.131~138.)

操作程序

聚丙烯酰胺凝胶的制备

1) 制备 20-cm×40-cm×1.5-mm 的凝胶，有 4 个宽 3 cm 的加样孔。对长度范围约为 10~45 碱基的寡核苷酸，宜采用 16% 的聚丙烯酰胺/尿素凝胶。对更长的寡核苷酸，可釆用 8% 或 6% 的聚丙烯酰胺/尿素凝胶。

2) 为制备 16% 的聚丙烯酰胺/尿素凝胶，可按如下配方混合：
丙稀酰胺 (38%;w/v)/双丙烯酰胺 (2%;w/v)             50 ml
TBE(l0x)                                                                12.5 ml
尿素                                                                       62.5 g
H₂0                                                                        17 ml
总体积                                                                   125 ml

3) 过滤，短暂脱气，然后加 750ul 10%(w/v) 过硫酸铵和 50ul TEMED。

4) 让凝胶聚合≥30 min, 再在 30W 下凝胶预电泳至少 1h。
注：凝胶的预电泳有助于去除过量的过硫酸盐离子，后者会使 DNA 发生降解。

5)—块凝胶可加的 DNA 童能制备出 1umol(约 1~2 mg) 合成寡核苷酸（所有 4 个 3-cm 加样孔都用上，每孔含 0.25umol 样品。这个 DNA 量大约是能加于凝胶而不致超载的最高限量。
注：DMA 在 16% 凝胶中的迁移性如下: 溴酚蓝可与长约 10 个碱基的寡核苷酸共迁移，二甲苯腈蓝可与长约 30 个碱基的寡核苷酸共迁移，若寡核苷酸的长度为 25~35 个碱基，则建议在甲酰胺加样缓冲液中只加入溴酚蓝。

样品的制备

1) 用适量甲酰胺加样缓冲液溶解寡核苷酸, 恰可使 50ul 样品加入一 3-cm 加样孔中。

2)65℃ 下加热样品 15 min, 以消除 DNA 中的二级结构。

3) 加样. 并将凝胶置于 30W 下进行电泳。溴酚蓝下行至凝胶的 3/4 处约需 4 h, 此条件足以纯化长为 15~30 碱基的寡核苷酸。

DNA 的回收

1）紫外 (UV) 造影鉴定主带 (通常为最大的寡核苷酸，但有时为次大的寡核苷酸)。
注：紫外造影操作如下。将聚丙烯酰胺凝胶置于两张塑料包装膜（如 Sarnn 包装膜）中间，再将凝胶放在一块含有荧光材料的薄板（如含有荧光色素的薄层层析板或放射自显影屏）上。用手持式紫外灯将长波长的紫外光照在凝胶上（时间要短！）。除 DNA 带所在位置外，荧光材料板上的其他所有地方都会观察到荧光（因为 DNA 能吸收紫外光）。这样，在 DNA 带下会出现影子。用钢笔在 DNA 带周围快速划下轮廓，然后在普通光下切下凝胶中对应的含有 DNA 的部分。

2) 小心地用刀片将 DNA 带切下，要努力避免将凝胶切碎（不要将胶条研成小碎片）。

3) 将凝胶块浸泡在 5 mlTE 缓冲液 (于 15-ml 聚丙烯塑料管) 中，于 37℃ 振摇过夜。

4) 于巴氏吸管中通过硅烷化玻璃棉过滤上清液。
注：巴氏吸管中的玻璃棉要預先用约 5 ml 的水浸泡，这很重要。

5) 用仲丁醇反复抽提浓缩 DNA。

6) 用二乙醚抽提 DNA—次，用 SpeedVac 旋转浓缩器真空去除残留的乙醚。

7) 用 TE 缓冲液将液体体积调至 180ul

8) 加 20ul 3mol/LNaOAc 和 2ul 1mol/LMgCl₂，震荡混匀。

9) 加 600ul 100% 乙醇，颠倒混匀。干冰/乙醇中（-78℃) 冷却 10 min。混合物室温下放置 5 min。室温下微型离心机高速离心 15 min, 沉淀 DNA。

10) 加 180ulTE 缓冲液，震荡溶解沉淀。

11) 加 20ul3mol/LNaOAc 和 2ul1mol/LMgCl₂, 震荡混匀。

12) 加 600ul100% 乙醇，颠倒混匀。干冰/乙醇中（-78℃) 冷却 10 min。混合物室温下放置 5 min。室温下微型离心机高速离心 15 min, 沉淀 DNA。

13) 加 800ul75% 乙辞沉淀 DNA, 震荡混匀。室温下离心 5 min。

14) 小心地用 SpeedVac 旋转浓缩器千燥沉淀（当心: 有时静电会使沉淀脱离离心管)。

15) 将 DNA 溶于 TE 缓冲液，储存于-20℃ 下。

16) 测量 A_260nm 和 A_280nm。
注：对于序列特异性 DNA 亲和介质，假定 1A_260nm 单位=40ug/mlDNA。