用肽适配体正向分析细胞过程实验2

通过配对相互作用或捕获法鉴定的肽适配体的假定靶点应当通过遗传学测试进行验

证，例如：

1. 用免疫沉淀法确定体内适配体的相互作用；

2. 通过上位（显）性分析以确定适配体在与靶蛋白相同的区域发挥功能；

3. 比较由靶蛋白删除或过表达引起的表型与由适配体造成的表型。

编码硫氧还蛋白肽适配体的 DNA质粒 DNA酵母株

完全极限（CM） 缺失成分液体培养基和平板捕获库

实验所需「材料」、「试剂」、「耗材」具体见「其他」

1. 用含有与 PEG202 多接头相容并与 LexA 编码框整合的限制酶切位点的引物进行 PCR 扩增编码硫氧还蛋白肽适配体的 DNA。

2. 用标准的亚克隆技术将 PCR 产物插入到 pEG202 中以构建出肽适配体诱饵。

3. 按照标准的乙酸锂转化法将各个肽适配体诱饵和 pSH18-34 （lacZ 报道质粒）转入 EGY48 （Mata） 中。同时用一对照质粒（PEG202）和 pSH18-34 转化 EGY48。

4. 在 10 cm Glu/CM-His、-Ura 平板上筛选转化株。

对于配对相互作用分析：

5a. 将所感兴趣的蛋白质的编码区插入 PJG4-5 的多接头处以构建该蛋白质的捕获质粒。

6a. 按照标准的乙酸锂转化法将捕获质粒和对照质粒（PJG4-5） 转入 EGY42 （Mata） 中。在 10 cm Glu/CM-Trp 平板上筛选转化株。

7a. 将含有肽适配体诱饵的酵母株与含有靶蛋白捕获质粒酵母株配对并评估其相互作用。

对于相互作用阱库捕获法：

5b. 用基因组或 cDNA 捕获库转化含有单个肽适配体和 PSH18-34 （步骤 3） 的酵母株。cDNA 和基因组捕获库的转化。

6b. 相互作用阱捕获方法筛选肽适配体的靶点。

1. 材料

编码硫氧还蛋白肽适配体的 DNA

质粒 DNA：pEG202，pSH18-34， pJG4-5

酵母株：

EGY42 ： Mata ura3 trpl his3 leu2

EGY48 ： Mata ura3 trpl his3 3LexA-operator-leu2

2. 试剂

完全极限（CM） 缺失成分液体培养基和平板，补加 2％ Cm/V） 葡萄糖 （Glu） 或 2％ （m/V） 半乳糖和 1％ （m/V） 棉籽糖（Gal/Raf）：

Glu/CM-His， -Ura （10 cm 平板）

Glu/CM-Trp （10 cm 平板）

捕获库