用随机寡核苷酸延伸法进行扣除cDNA探针的放射性标记

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段 反转彔酶 随机脱氧核苷酸引物 模板 mRNA

二硫基苏糖醇 乙醇 EDTA NaOH 胎盘 RNA 酶抑制剂 随机引物缓冲液 醋酸钠 dNTP 溶液

Sephadex G-50 离心柱 微量离心管 水浴

一、材料

1. 缓冲液和溶液

二硫基苏糖醇（DTT) (1 mol/L）

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

乙醇

HCl ( 2.5 mol/L)

NaOH ( 3 mol/L)

酚：氯仿（1:1，V/V)

胎盘 RNA 酶抑制剂

5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris ( pH 8.0)，25 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L DTT，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6)，使用 1 mol/L DTT 贮存液的新稀释水溶液，贮存于 -20℃。用后弃去稀释的 DTT。）

SDS ( 20% m/V)

醋酸钠（3 mol/L，pH 5.2)

Tris-Cl (1 mol/L，pH 7.4)

2. 酶与缓冲液

大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段

反转彔酶

10X 反转录酶缓冲液

3. 核酸与寡核苷酸

含 4 种 dNTP 各 5 mmol/L 的（完全）dNTP 溶液

含 dCTP、dGTP 和 dTTP 各 5 mmol/L 的 dNTP 溶液

oligo (dT)_12-18

长度为 6 或 7 个碱基的随机脱氧核苷酸引物

模板 mRNA

4. 放射性复合物

[α-³²P] dATP ( 10 mCi/ml，比活性为 >3000 Ci/mmol）

[α-32P] dCTP ( 10 mCi/ml，比活性为 800~3000 Ci/mmol）

5. 专用设备

Sephadex G-50 离心柱，平衡于 TE（pH 7.6)

硅化的微量离心管（1.5 ml）

预热至 45℃、60℃ 和 68℃ 的水浴

二、方法

1. 4℃ 下在一个灭菌的微量离心管中混合下列成分以合成 cDNA 第一链：

模板 RNA (1 mg/ml）                 10 μl

oligo(dT)_12-18 （1 mg/ml）         10 μl

5 mmol/L dNTP（完全）溶液      10 μl 

50 mmol/L DTT                           1 μl 

10X 反转录缓冲液                        5 μl

10 mCi/ml [α-32P] dCTP              5 μl

( 比活性 800 或 3000 Ci/mmol）

胎盘 RNA 酶抑制剂                     25 单位

无 RNA 酶的水                           加至 46 μl

反转录酶（~800 单位）               4 μl

2. 检测放射性标记的 dNTP 掺入 TCA 可沉淀物或结合于 DE-81 滤膜的比率。用下列公式计算 cDNA 第一链的产率。



3. 加入下列试剂以终止反应：

0.5 mol/L EDTA (pH 8.0)     2 μl

20% (m/V) SDS                 2 μl

充分混匀微量管中的各成分。

4. 在反应管中加入 5 μl 3 mol/L NaOH，于 68℃ 温育反应 30 min 以水解 RNA。

5. 将反应物温度冷至室温。加入 10 μl 1 mol/L Tris-Cl (pH 7.4)，充分混匀以中和溶液，然后加 5 μl 2.5 mol/L HCl。点一小滴溶液（<1 μl）在 pH 试纸上以检测溶液的 pH。

6. 用酚:氯仿抽提纯化 cDNA。

7. 用 Sephadex G-50 离心柱层析分离放射性标记的探针与未掺入的 dNTP。

8. 进行两轮扣除杂交。

9. 用异丁醇序贯抽提浓缩 cDNA，通过 Sephadex G-50 层析除盐。

10. 用标准乙醇沉淀回收 cDNA。将 cDNA 溶于水，终浓度为 15 ng/μl。

11. 为了对扣除 cDNA 进行高比活性的放射标记，在一个 0.5 ml 微量离心管中混合下列成分：

扣除 cDNA                                     5 μl

随机脱氧核苷酸引物（125 μg/ml）   5 μl

12. 加热混合物至 60℃ 5 min，然后冷却到 4℃。

13. 向引物：cDNA 模板混合物中加入：

5X 随机引物缓冲液               10 μl

含 dCTP、dGTP 和 dTTP

各 5 mmol/L 的 dNTP 溶液    5 μl

10 mCi/ml [α-³²P] dATP

( 比活性为 >3000 Ci/mmol） 25 μl

Klenow 片段（12.5 单位）    2.5 μl

水                                       加至 50 μl

室温下反应 4~6 h。

14. 加入下列试剂以终止反应：

0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0)   1 μl

20% (m/V) SDS                2.5 μl

15. 用 Sephadex G-50 离心柱层析分离放射性标记的 cDNA 与未掺入的 dNTP。