本方案参照了 Tabor 和 Richardson(1987a,1989b,1990) 的方法，采用单链 DNA 模板进行 DNA 测序（有关单链 M13 噬菌体和质粒 DNA 制备，请参见第 3 章的方案 4、8 和第 12 章的方案 1)。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。
| 试剂、试剂盒 | 去离子蒸馏水二硫苏糖醇dNTP 和 ddNTP标记混合液和 ddNTP 延伸 终止混合液甲酰胺上样缓冲液测序酶稀释缓冲液测序酶反应缓冲液含MgCl2测序酶酵母无机焦磷酸酶寡核苷酸引物模板 DNA放射性化合物 |
|---|
| 仪器、耗材 | 离心机和转头微量离心管或微量滴定板 |
|---|
| 实验步骤 | 材料
缓充液和溶液
去离子蒸馏水（冰预冷）
二硫苏糖醇（DTT)(100 mmol/L)
dNTP 和 ddNTP，dNTP(0.5 mmol/L) 和 ddNTP(0.5 mmol/L) 储液
5X 标记混合液和 ddNTP 延伸/终止混合液（ddCTP、ddTTP、ddATP、ddGTP)
这些反应混合液可按表 12-5 给出的溶液体积混合配制。
甲酰胺上样缓冲液
测序酶稀释缓冲液
10 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)
5 mmol/L DTT
0.5 mg/ml 牛血淸白蛋白
-20°C 储存
5X 测序酶反应缓冲液，含 MgCl2
200 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
100 mmol/L
125 mmol/LNaCl
-20°C 储存
5x 测序酶反应缓冲液，含 MnCl2
200 mmol/LTris-Cl(pH7.5)
25 mmol/LMnCl2
125 mmol/LNaCl
-20°C 贮存
在测序酶反应缓冲液中含有 Mn2+可以增加测序酶利用 ddNTP 的效率，即使有 Mg2+存在也是如此 (TaborandRichardsonlSS%)。结果使在测序反应中靠近引物部分产生有效终止，进而增强靠近寡核苷酸引物处条带的强度，或者当使用 dITP 碱基类似物时，有利于消除富含 GC 区序列的影响。
为了使用 Mn2+，可在加入测序之前在标记反应中加入 1ul 含有 MnCl2 的 5x 测序酶反应缓冲掖 (Fuller et al.1996) 或者加入 0.01 体积的 1mol/L MnCI2 至双脱氧-dNTP 廷伸/终止混合液中（Kristmse et al.1990)。含锰的缓冲液如呈淡黄色或产生黄褐色沉淀将不能使用。
TE(pH7.6)
酶和缓冲液
测序酶（2.0 版）
测序酶由生产商提供，浓度为 13u/ul(约 lmg/ml)。-20°C 储存（不要使用无霜冰箱）。
酵母无机焦磷酸酶
可选用，请参见步驟 6。厂商（USB/Amersham Life Science 公司）提供的酶浓度为 5u/ml，它可催化焦磷酸水解为 2 分子正磷酸盐。
焦磷酸酶与测序酶以 1:3 的比例混合，最好采用等体积混合两种酶，并用 6 倍体积的酶稀释缓冲液稀释该混合钧。测序酶的工作浓度为 1.6u/ul, 同时加入足量焦磷酸酶以防止焦磷酸的积累，每个测序反应需 2ul 稀释的酶混合液。
核酸和寡梭苷酸
寡核苷酸引物
浓度为 0.5pmol/ul(约 3.3ng/ul), 溶于水或 TE(pH7.6) 中。
请参见信息栏"DNA 测序寡核苷酸引物储液制备”。对于一些结合于靶区域上游载体序列的通用引物, 可参见第 8 章信息栏“通用引物”。
模板 DNA(lug/ul) 溶于 TE(PH7.6) 中
每一套测序反应需要 1ug 单链 DNA 或 2.0ug 变性双链质粒 DNA。双链线性 DNA 需要变性，并使它与引物复性。即先把天然模板 DNA 与过量的引物混合，在沸水浴中加热约 2 min, 然后把试管插入冰水浴中。不要让混合液溫度回升，立刻使用。
小规模制备 M13 噬菌体重组于单链 DNA 的浓度一般在 0.05-0.5ug/ml 的范围内。这取决于特定噬菌体的生长速度。在正常测序反应条件下，模板 DNA 是过量的。因而毎次测序反应中模板量上的微小变化并不影响测序结果的质量。可参见本方案末尾的表 12-6。
放射性化合物
[a-35S]dATF(1000Ci/mmol，10mCi/ml) 或
[a-33P]dATP(1000~3000Ci/mml, 约 20mCi/ml) 或
[a-32P]dATP(1000Ci/mmol,10mCi/ml)
若不用放射性标记的 [32P]dATP 作为内标记，也可以用 5'端以 35P 标记的寡核苷酸引物进行测序反应，此时可用 2ul 放射性标记引物（约 5X105cpm; 约 0.5ng) 和 2ul 水代替反应中的未标记引物（步骤 1) 和放射性标记 dATP(步骤 7), 其他步骤相同。一般用多核苷酸激酶催化 ATP 的 [γ-32P] 转移至寡核苷酸 5‘末端。详细步骤见第 10 章的方案 2。
离心机和转头
离心转头或用于 0.5 ml 微量离心管的衔接头，以及甩平式转头和微量滴定板架 (如 Sorvall 公司产品），聚苯乙烯泡沬或橡胶衬垫。
专用设备
微量离心管（0.5 ml）或微量滴定板（柔韧，耐热，每孔容量约为 300ul 的 U 型底 96 孔板)
参见信息栏“微量滴定板”。
可加热到 37°C 和 65°C 的水浴或加热板。
方法
重要：当测序的双链质粒 DNA 已经变性，并已与引物退火（方案 2), 可以忽略本方案的前两步. 直接从步骤 3 开始。
1. 在 0.5 ml 微量离心管或微量滴定板孔中加入：
单链模板 DNA(1ug/ul) 1ul
寡核苷敢引物（约 1ng/ul) 3ul
5X 测序酶反应缓冲液 2ul
含 MgCl2 或 MnCl2
水 至终体积 10ul
2. 封闭试管，在 65°C 温育 2 min，然后取出离心管，使之在 3~5 min 内冷却至室温。
有些实验人员喜欢用小加热板或装水的烧杯，使该退火反应在 30 min 的过程中缓慢冷却。我们实验中发现，这两种方法的实验结果相同。
3. 在引物和模板降温时，融化 5X 标记混合液、ddNTP 延伸/终止混合液和放射性标记的 dATP，融化后置于冰上。若有必要，退火的棋板和引物可在-20°C 下保藏几个月。
4. 取 2.5ul 每种 ddNTP 延伸/终止反应混合液加至用彩色标记或用字母 C、T、A、G 标记的各个 0.5 ml 微量心管或微量滴定板各孔中。
当液滴挂在离心管壁或微量滴定板孔壁时. 应离心使之沉入底部。
5. 将 5x 标记混合液用冰预冷的水稀释 5 倍，每种测序反应需要 2ul 稀释的标记混合液。
6. 用冰预冷的测序酶稀释缓冲液稀释测序酶，如材料中所述可加，也可不加酵母焦磷酸酶。
毎种模板测序需要测序酶（含 3 单位)。测序酶要始终放置于冰上。
7. 为进行标记反应，在步骤 2 的 10ul 退火反应液中加入如下溶液:
稀释的标记混合液（来自步骤 5) 2ul
0.1mol/L 二硫苏糖醇 1ul
[a-33P]dATP,[a-32P]dATP 或 [a-35S]dATP 0.5ul
稀释的测序酶（约 1.6u/ul) 2.0ul
轻轻拍打离心管壁或滴定板以便混匀反应物，然后在 20°C 孵育 2~5 min。
稀释的测序时应保存在冰上，不要使其温度升至室温。供应商提供的浓缩酶应贮存于-20°C, 如果置于冰上几小时酶将失活。
8. 在标记反应将近完成时，应于 37°C 预热离心管或微量滴定板以便进行终止反应。这—步很重要。然后，转移 3.5ul 标记反应液到已经预热的、做好标记的、已加入适量的双脱氧混合液（上述步骤 4) 的微量离心管壁或微量滴定板孔壁上。
9. 在室温下，将微量离心管放入微量离心机中（用适合于 0.5 ml 离心管的转头或衔接头，或将其置于去盖的 1.5 ml 离心管中），或将微量滴定板置于有适当衔接头的离心机中，以 2000r/min 离心 C、T、A、G 管或板几秒钟，混匀混合液。然后立即将反应物置于 37°C 加热板或水浴中 3~5 min。
10. 加 4ul 甲酰胺上样缓冲液终止反应。
11. 这些反应物在-20°C 时可最多保存 5 天，也可以用变性凝胶电泳直接分析（见方案 8、9、或 10、11 和 12)。热变性后（100°C,2 min), 在冰上快速冷却。取 C、T、A 和 G 反应物各 3ul 加入测序凝胶的各孔中。
 |
|---|
