电子显微镜免疫细胞化学技术2

（1）包埋剂的配制：商品提供的Lowicrys包埋剂由三个部分组成：单体（Monomer），交联剂（Crosslinker）和引发剂（Initator）。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下：
K4M：单体 17.30g
交联剂 2.70g
引发剂 0.10g
K11M：单体 19.00g
交联剂 1.00g
引发剂 0.10g
作者的经验，可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻棒轻搅3～5min或用一小管通入液氮气泡以搅拌之。勿过分搅拌，以防氧的气泡进入包埋剂中。
（2）生物样品处理程序（Lemanski 等1985）
①动物麻醉取材，以多聚甲醛—赖氨酸—过碘酸钠在9℃固定2h。
②磷酸缓冲液含7%蔗糖，pH7.2,冲洗过夜，0℃
0.1mol/L ③磷酸缓冲液，pH7.2,冲洗，0℃
④脱水：65%乙醇，1h ,0℃
80%乙醇，2h,-35℃
Lowicryl K4M：80%乙醇=1：11h -35℃
Lowicryl K4M：80%乙醇=2：11h -35℃
100% Lowicryl K4M 1h -35℃
100% Lowicryl K4M 过夜-35℃
⑤包埋：新鲜K4M置于胶囊内，将组织移入，在-30℃～-40℃以紫外线灯波长360nm 2× 15W（Ladd Research Industries Burlington VT）相距30～40cm照射24h使之聚合。如为100W灯泡，照射距离应大于85cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。
（3）免疫染色
①切片（厚50～70nm）贴在金网或覆有碳膜的镍网上。所有下列步骤在室温、湿盒内进行。所有溶液需经微孔滤纸（0.25～0.45μm）滤过。
②正常羊血清30min。
③第一抗血清（PBS稀释），37℃2h。
④可用烧杯法（或塑料壶喷洗法），以镊夹镍网在第一烧杯中洗荡30min，然后在第二烧杯中洗荡1h 。
⑤正常羊血清30min。
⑥第二抗血清（胶金标记抗体）以正常羊血清稀释为1：1，以镍网置于血清滴上孵育1h。
⑦冲洗如④。
⑧覆于2%OSO4水溶液上，30min。
⑨冲洗如④。
⑩干燥后在电镜下观察。
（4）Lowicryl K4M快速包埋染色法（Altman等1984）
①包埋剂的配制：单 体13g
交联剂2g
引发剂75mg
②生物样品处理：除了聚合这一步骤外，下列所有步骤都在20℃进行。
1）组织用3%戊二醛—3%多聚甲醛磷酸缓冲液，pH7.4,在20℃固定1～2h。用磷酸缓冲液清洗后进行脱水。
2）脱水：在50%、75%和90%的双甲基甲酰胺（Dimethylformamde,DMF）内系列脱水，每步10min。
3）浸透：Lowicryl K4M:DMF=1:2 10min
Lowicryl K4M:DMF=1:1 15min
100% Lowicryl K4M 20min
100% Lowicryl K4M 25min
4)包埋与聚合：组织移入装满K4M的胶囊中，以紫外线灯照射聚合（紫外线灯条件同上），灯和组织距离10cm,4℃照射45min，组织块在室温进行超薄切片（切片时水槽内水面应略低以防浸湿组织块的切面）。
5）以覆有碳膜的镍网捞取切片。
6）免疫染色。
整个包埋时间仅需4～5h。
Lowicryls 应保存在暗处，-4℃，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部，氧化重金属如KmnO4能与包埋剂作用而影响染色效果，以不用为佳。