电泳、转膜

转膜是把DNA从琼脂糖凝胶中转移到固相支持物（一般是尼龙膜）上固定，是进行各种后续研究（如RFLP分析，阳性克隆的筛选验证等所有涉及分子杂交的研究）的前提。

实验目的：

掌握Southern blotting的原理及操作步骤。

实验原理：

1. 转膜的方式：

　　向上的毛细管转移

　　向下的毛细管转移

　　同时向两张膜转移

　　电转移

　　真空转移

2. 固相支持物的种类及选择：

　　硝酸纤维素膜：非共价结合，易脆，易丢失DNA，< 500 bp的DNA无效，转膜前的工作（从提高转膜效率,利于转膜后使用等）。

　　尼龙膜（带正电荷的）：高强度，不易破损，具有较大的DNA结合容量，它能够吸附变性DNA，核酸以共价结合方式不可逆的结合在尼龙膜上。尼龙膜两边均有同样吸附DNA功能，无论用哪边均可以经久耐用，可反复利用10次以上（10-20次），经毛细管（毛细吸附）作用，把DNA从凝胶上转到膜上。DNA转到膜上是复制胶上的带型，在80-100℃真空干燥2-4hrs，即可固定DNA。

3. 转移缓冲液（transfer buffer）的选择：

　　带正电荷的尼龙膜：可用高盐离子强度（SSC），但不能充分发挥膜潜能；0.4N NaOH，共价结合DNA是最大优点。

　　硝酸纤维膜：高盐离子强度促进DNA与膜结合（20×SSC），低盐离子强度导致小片段DNA在转移过程中丢失，pH>9，DNA不能与膜结合。

4.转膜时间（duration of transfe）约12 hrs

　　取决于毛细管系统，DNA大小，胶厚度（＜5mm）及浓度（＜1%）。DN分子量A大小决定时间长短，部分去嘌呤减小DNA，碱转移2hrs大部分结合到膜。DNA转移的效率较难判断，只有在转膜结束后，通过EB染色及分子杂交才可以鉴别效率高低，但已无补救措施，因此，每一步应严格操作。

实验材料及试剂：

酶消化好的DNA样品，尼龙膜，0.2N HCl，0.4N NaOH等。

实验步骤：

1. 0.8%琼脂糖电泳
　　制胶：注意琼脂糖的质量，胶的浓度，厚度（<5mm）及均一性。一般大电泳槽配制250ml 0.8%琼脂糖凝胶，采用42孔梳子（经济，高效）制样；
　　点样：DNA样品中指示剂量稍多。
　　电泳：一般1～1.5V/cm的电压，使DNA迁移到适当距离，一般指示剂约移动10～11cm（大电泳槽：40V×12～15hrs，小电泳槽30V×4～5hrs） 。

2.转膜前的准备：
　　依胶大小每块凝胶准备两张比胶稍大的滤纸（11×12.5cm），两张用作盐桥的滤纸，一张与胶同样大小的尼龙膜（10×10.5cm），两个玻璃盘、两块有机玻璃板、一根玻璃棒，比尼龙膜稍大的一叠吸水纸等。

3.一玻璃盘中加入足量的0.4N NaOH，放上洗净的玻璃板，按图示搭制盐桥（操作示范）。

4.凝胶的预处理： 
　　a) 从电泳槽中移出凝胶置于塑料板上，用切胶板把胶切成适当大小，切去右上角（最后一个样品的最前端）作为电泳方向记号。
　　b) 把凝胶翻面，放入加有足量的0.2N HCl玻璃盘中，轻轻摇动10min，使指示剂变黄色为止（脱嘌呤）。
　　c) 倒去HCl溶液，加蒸馏水漂洗凝胶。
　　d) 倒去蒸馏水，加0.4N NaOH中和。
　　e) 同时在盐桥滤纸上洒些0.4 NaOH，立即将胶放在盐桥上（忌气泡） 。

5.胶的四周用塑料片与胶紧紧相连，防止短路（吸水纸与盐桥相接）。

6.在胶面上倒足够量0.4N NaOH，小心放置膜（预湿0.4N NaOH）使膜覆盖整块胶（要求一次成功，不能移动） 。

7.膜上放2张滤纸，滤纸大小为15×12cm。

8.放不少于5cm厚的吸水纸，放上玻板，其上压约500g的重物，转膜12 hrs左右。

9.转膜完毕，用2×SSC漂洗膜两次，各五分钟。用EB染胶以检测转移效果。

10.用两张滤纸包住膜，置于80～100℃的真空干燥箱中，干燥2～4 hrs。