疫磁珠法分离B细胞亚群

基本方案

材 料

抗 凝 血（附 录 3 G) ， 或 者 从 全 外 周 血 中（单 元 8 . 1 ) 或 组 织 中（单 元 7. 8 ) 分离的新 鲜 PBM C 或冷藏保存的 PBMC (附录 3B)

1 % FBS (热灭活）溶于冷的 PBS (附 录 1 ，无钙离子）中

免疫磁珠偶联的抗 C D 1 9 抗 体（4 X 10⁸ 个细胞/ml; Dynal)

冷 的 RPMI-IO 完全培养基

25 cm2 和 75 cm2 细 胞 培 养 瓶（如 Coming)

15m l 和 50m l 聚 丙 燦 试 管（如 Falcon)

磁 性 分 离 装 置（ Dynal MPCI 或者 Perspective Diagnotics BioMag Separator) 或 强磁铁

摇 床 ， 4°C

Detach-a-bead (Dynal) ， 可选用

Ia.抗凝血的处理：用 3 倍体积的含 1 % F B S 的 P B S 稀 释 5〜50m l 血 于 75 cm2 细胞培养瓶 ，冰浴。

Ib. 已分离 P B M C 的处理：用冷的含 1 % F B S 的 P B S 重悬细胞于 15m l 聚丙烯试管，浓度 为 I X l O ⁷〜2 X 10⁷ 个细胞/ml (附录 3A ) ，冰浴。

2 . 剧烈振荡磁珠包被的抗 CD1 9 , 加 入 至 15m l 聚丙烯试管中。每 个 靶 细 胞 加 4〜1 0 个磁 珠（如 每 I m l 未稀释的血样或者 P B M C 加 5 〜12. 5 ul D y n a l 磁 珠 ，估计全血含细
胞 为 5 X IO⁵ 个细胞/ml)。

3 . 加 入 IO m l 冷 的 1 % F B S ，振荡，用磁性装置或者强磁铁将磁珠吸引至管壁。等待约5m in 使磁珠聚集至贴近磁铁处，将注射器尖端置于管底吸出液体。

4 . 重复步骤 3 , 然 后 用 1〜2m l 冷 的 1 % F B S 重悬磁珠，将磁珠加入含血样的培养瓶中(步骤 la) 或者含 P B M C 的 15m l 离 心 管 中（步 骤 lb)。在摇床上以 6〜lOr/m iri 转速，4°C 孵 育 30 min (这一转速能够充分混合细胞和磁珠而不致破坏细胞）。可以取部分细胞在显微镜下观察以确定磁珠围绕于某些细胞周围，而不存在于另一些细胞周围。

5 . 用磁性装置分离细胞（步 骤 3)。用注射器尖端置于瓶底或管底收集未结合细胞。将培养瓶或离心管脱离磁场，用 IOml 冷 的 1 % F B S 重悬磁珠。

6 . 重复步骤 5 不 少 于 5 次 。最后一次分离后，不再重悬磁珠。
帽化法解离与磁珠结合的 B 细胞

7a. 用 IOml 冷 的 R P M I -I O 完全培养基重悬结合磁珠的细胞，转 移 入 25 cm2 细胞培养瓶，在 37°C ， 5 % C. 〇 2 培养箱中孵育过夜。

8a. 重悬细胞于 15m l 管中，室温下磁性分离免疫磁珠（现在已经从细胞上脱离）。吸取未结合的细胞悬液至新的 15m l 管中。如果需要，重复分离去除多余的磁珠。

9a. 4°C ， 150 g 离心细胞 lOmin，弃上清，以适当浓度重悬细胞于冰冷的 R P M I -I O 完全培 养 基 中（或者其他适当培养基）。用流式细胞仪检测纯度（单 元 4. 2)。

用 Detach-a-b e a d 多克隆抗体解离 B 细胞

7b.用 IOOuI 冷 R P M I -I O 完全培养基重悬结合磁珠的细胞，转 移 入 15m l 管 中 ，加入10ul(I U ) Detach-a-bead，摇 床 上（如 orbital 摇床）室温孵育 45〜60 min。确保细胞沉于管底。

Detach-a-b ead 是 一 种 能 够 与 小 鼠 单 克 隆 抗 体 的 F a b 片 段 结 合 的 多 克 隆 抗 体 ，因 而 可 打 断 细 胞 与 磁 珠 的 连 接 。

8b. 用 7m l 冷 的 RPM I- 1 0 完全培养基重悬细胞，将试管放入磁场分离免疫磁珠。注射器尖端置于瓶底或管底收集未结合细胞悬液至新的 50m l 置于冰浴的离心管中。重复 2 或 3 次 ，将细胞悬液倒入同一离心管中。

9b. 4°C ， 150 尽离心细胞 lOmin，弃上清，重悬细胞于冰的 R P M I -10 完 全 培 养 基 中（或者其他适当培养基），再次离心。重 复 洗 1 或 2 次或者多次，以适当浓度重悬细胞于 冰 的 R P M I -1 0 完全培养基中，流式细胞仪检测纯度 （单 元 4. 2 )。