癌症为什么发生在特定细胞里？单一细胞测序可以解答！

　　 我们都知道癌症的起源离不开细胞突变，我们体内很多细胞的突变都可能会引起癌症，但相应的是，也有很多突变并不会导致癌症的发生，而如何辨别这些突变会不会引起癌症便是一个癌症早期防治的关键问题，在最新发表的一篇研究报告中，研究人员们探究了视网膜母细胞瘤与特定细胞突变的关系。

Frolov 与 Ariss以及单一细胞测序仪

　　该研究结果发表于 2018 年 11 月 27 日的 Nature Communications,由来自美国伊利诺伊大学芝加哥医学院的生物化学和分子遗传学教授 Maxim Frolov 的团队完成。

　　研究背景

　　视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）的功能失活通常被认为是该处癌症发生发展过程中一个必不可少的事件，研究者通常认为这种联系是因为它通过夫调控 E2F 转录因子阻断细胞周期进程的能力导致。当 E2F 与 pRB 结合后，它自身的转录活性会被抑制并终止细胞周期同时，pRB 则会释放 E2F 并允许 S-phase 进入——这些简单的观点建立在一个假设之上：即 pRB 在不同单元类型之间以相同的方式运行。

　　然而小鼠模型和临床研究的结果表明，pRB 的功能受细胞环境的影响很大，pRB 失活的后果被认为是由围绕 pRB 一种独特的细胞类型特异性分子电路决定，这种特定的相互作用也有助于解释为什么癌症会起源于特定的细胞类型。

　　例如，人类视网膜母细胞瘤被认为起源于有丝分裂后锥细胞的前体，这些细胞对 Rb 损失表达锥血统因素（TRβ2 and RXRγ）和癌蛋白基因 MYCN、MDM22 格外敏感。因此，了解 Rb 通路中的突变如何影响各类型细胞也就显得格外重要。

　　研究手段

Ariss 制作的单一细胞 RNA 测序仪

　　在最近的发展中，单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）的研究进展位检测细胞水平的变异和将异质组织解剖成独特的细胞团提供了新的可能，在过去的研究中，研究者很难只收集一种细胞类型的纯样品，科学家不得不使用从整个组织中提取的大量样本——使用这些样本检测 RB 突变影响的结果并不能准确地代表 Rb 突变如何影响特定类型的基因表达。

　　然而有了 scRNA-Seq 技术，研究者们可以研究单个细胞中的基因表达，从而消除细胞样本受污染的问题。 Frolov的实验室采取了一种名为 Drop-seq 的测序技术，可以同时对数千个细胞进行单独的测序并排序。

　　而在模型生物的选择上，研究者们选择了果蝇，因为它们具有哺乳动物 RB 通路的流线型版本，Rbf 在果蝇幼虫眼成像盘中的失活导致细胞周期的缺陷和凋亡——这些都与哺乳动物一致。

　　Rbf 突变的眼盘是应用 scRNA-seq 方法以及研究会使 Rbf 突变细胞对凋亡敏感的那种特定细胞环境的理想设置。

　　研究概述

　　Frolov的研究团队研究了 11500 个野生型果蝇的眼盘细胞并制作了图谱。

　　研究者首先利用 Drop-seq 在第三龄幼虫眼盘构建细胞目录，在其视柄和视触角区解剖，分离成单细胞悬浮液，在 11 个生物复制过程中解剖 550 个眼盘并执行 scRNA-seq，在质量控制后，从 11416 个单个细胞中收集测序数据，共检测到 16331 个基因，随后使用 Seurat8 进行了 tSNE 分析确定了 15 个不同的细胞群，使得样品间没有明显的批量效应。

　　之后研究者们使用 scRNA-seq 鉴定了一个 Rbf 突变特异性细胞簇，他们对 Rbf120a 突变体眼盘进行了 3 次复制，得到 5203 个 Rbf 突变细胞的 scRNA-seq 数据集，然后选取了 5591 个野生型细胞，将这两份数据集进行 tSNE 分析并比对，得到结果如下。

　　结果表明选取标志物的变化倾向与之前观察到的结果一致，另一方面研究者发现，Rbf 突变会导致糖酵解基金表达上调，致使糖酵解活性增加而降低细胞内的 PH 值，而细胞内的酸化会增加 Rbf120a 细胞的凋亡。

　　Frolov的实验也证明了 scRNA-seq 在对细胞改变方面的价值，如果使用 RNA-seq 之类的传统方法，无法检测到这些突变。

　　同时，这些实验结果也在强调高分辨率野生型细胞图谱在绘制突变体 scRNA-seq 数据集中的价值，不止 Frolov注意到 scRNA-seq 在样本间具有显著的可重复性。

　　研究者的话

　　“这是首次在果蝇眼睛细胞中进行单一细胞 RNA 测序，我们必须创建一个全面的图谱来准确描述正常眼睛中每种细胞类型的基因表达，之后再依靠这个图谱来确定 RB 突变如何影响眼睛中每种细胞类型的基因表达。” Frolov说道，“我们在 RB 突变细胞的观察中，发现那些代谢的改变使它们变得脆弱，而在治疗时我们可以利用这些这种脆弱，在其他突变来袭时使它们对细胞死亡具有抵抗力，这些影响仅限于如此小的一组细胞，所以之前在分析中通常都会被忽略。”

　　为了搭建研究中重要的 Drop-seq 平台，论文第一作者 Ariss 耗费了三个多月的时间，他们是伊利诺伊大学芝加哥医学院第一批做单一细胞测序的人，因此也得不到更多的指导。

　　Ariss 表示：“这是一项真正革命性的技术，有望揭示癌症的起源，以及为什么会从某种细胞发源而不是别的类型，在过去的一年半里，我们进行了一百多个实验，从果蝇器官、小鼠肿瘤以及人类细胞系中产生了超过 10 万个细胞的转录组，我们希望更多的研究者未来也可以使用它。”

　　参考文献：

　　1、Majd M. Ariss et al, Single cell RNA-sequencing identifies a metabolic aspect of apoptosis in Rbf mutant, Nature Communications (2018).

　　2、Dick, F. A., Goodrich, D. W., Sage, J. & Dyson, N. J. Non-canonical functions of the RB protein in cancer. Nat. Rev. Cancer 18, 442–451 (2018).

　　3、Xu, X. L. et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature 514, 385–388 (2014).

　　4、Moon, N.-S., Di Stefano, L. & Dyson, N. A gradient of epidermal growth factor receptor signaling determines the sensitivity of rbf1 mutant cells to E2F-dependent apoptosis. Mol Cell. Biol. 26, 7601–7615 (2006).

　　5、Macosko, E. Z. et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell 161, 1202–1214 (2015).