皮下荷瘤实验的介绍及应用（二）

第二部分：裸鼠皮下荷瘤步骤

一般更多的时候是选择人源肿瘤细胞系，然而由于存在免疫排斥，需选择裸鼠荷瘤。

下面以裸鼠为例，为大家详细介绍皮下荷瘤的实验过程

⑴ 肿瘤细胞的传代扩增

取冻存于液氮的肿瘤细胞复苏并扩增，确保肿瘤细胞的活力和良好的生长状态

⑵ 计算细胞接种量

根据经验，一般鼠源肿瘤细胞接种2～100万/只，而人源肿瘤细胞则需要200-1000万/只以上。当然最好结合文献来确定细胞接种量，在找不到相关资料的情况下，最高就用到1000万/0.1ml，不可再高（因为细胞悬液已达饱和状态）。并且提前计算确定细胞数量，一般注射40只小鼠，至少需要准备50只小鼠的细胞量。

⑶ 准备裸鼠

一般选择5-6W裸鼠，小于4W动物可能不耐受而过早死亡，大于6W免疫力会增强，不易成瘤；

每批实验只用同一性别动物，通常雌雄均可，但是根据研究的肿瘤类型及肿瘤细胞系选择（乳腺癌等要选择雌性，前列腺癌等要选择雄性）

⑷ 操作步骤（请观看视频）

① 接种时选择好部位进针，建议接种前酒精棉球擦拭消毒进针位置；

② 向前方穿行，注射前针头稍微动一动，能动说明在皮下，否则可能在皮内或者肌肉内；

③ 针头在皮下走一段再注射，速度不可太快，一般体积为100-200μL（PBS或者无血清培养基稀释细胞，若不易成瘤可添加matrigel促进成瘤），可看见明显的鼓包；

④ 接种点离进针点尽量较远，减少漏液和污染的可能；

⑤ 注射完毕后，缓慢退出针头，尽量避免漏液；

⑥ 细胞需一直置于冰上，使细胞处于比较低的代谢状态，一般2h之内不会有问题。

下面为皮下荷瘤视频（包括各个部位的注射手法）：

第三部分：后续实验安排

⑴ 分组：一般来说皮下荷瘤主要用于抗肿瘤药物的检测，因此我们一般分为对照组，阳性药物组，低剂量、中剂量及高剂量药物组等；

⑵ 数量：荷瘤时每组不少于10只，考虑到小鼠成瘤率和死亡原因，最终实验应至少可以获取6个有效数据；

⑶ 给药时间：一般接种7-10天后便可看到肿瘤长起，便可分组实验（鼠源细胞系会更快）；

⑷ 人道终点：动物伦理学规定，小鼠肿瘤重量不可超过小鼠体重10%，平均肿瘤直径不超过20mm，并且如果出现溃烂，造成感染或坏死时，应该中止实验且对动物施行安乐死。

补充正常免疫小鼠的荷瘤

基本步骤与裸鼠荷瘤一致，只是比较繁琐的是，由于野生型小鼠有毛发，所以需要剃毛（如上图Balb/c小白鼠腹股沟皮下荷瘤鼠源结肠癌CT26）

第四部分： 皮下荷瘤的几点问答

⑴ 瘤子长不出来是怎么回事？

一方面可能是细胞状态差，活力不好，或是肿瘤细胞不易成瘤，需加入Matrigel辅助或增大接种量或更换细胞系；一方面可能是小鼠周龄太大，或小鼠免疫排斥，建议更换免疫缺陷程度更大的小鼠（Nod-scid小鼠，NOG小鼠＞ Nude裸鼠）

⑵ 小鼠瘤子长起来又消失？

肿瘤块先缩小，后变大很常见，很可能是炎症反应，肿瘤细胞被小鼠自身吸收，继续观察肿瘤细胞吸收之后是否经过几周还能长出来，长不起来建议换鼠。

⑶ 均一性很差，肿瘤体积差距较大？

如果荷瘤分组发现小鼠肿瘤体积差距很大，这可能跟小鼠周龄及接种细胞量不一致导致，建议重新做实验分组。

⑷ 是否可以在一只小鼠进行多个点荷瘤？

不可以，一只老鼠就只能接种一个点。因为一个老鼠身上有多个肿瘤块的情况下，可能会相互影响。

⑸ 是否应用免疫抑制剂加速肿瘤生长？

如果裸鼠荷瘤不生长，可以参考文献，用免疫抑制剂如环磷酰胺（抑制裸鼠NK细胞活性）促进生长；不过最好不要为了缩短造模周期来加速生长，因为可能会造成溃烂，这样就不得不中止实验。所以一般情况下，应尽量符合细胞系本身的生长特性，不应过多地人为的干扰。

皮下荷瘤实验介绍就到此结束了，原来看似简单的实验却有多种不可忽视的因素需要考虑。

简单回顾一下，皮下荷瘤模型中细胞系和小鼠品系是最需要考虑的两大因素，切记一定要多查阅文献并结合预实验，进而找到最合适的皮下肿瘤模型。