盐提和碱提酸沉两种方法提取腰果蛋白的结构及分析

　　腰果为世界著名四大坚果之一。腰果仁中还含有21%的蛋白质，与花生（约23%）、葵花籽（约20%）等坚果种子蛋白含量相当，并且腰果蛋白的氨基酸种类和含量与人体氨基酸模式十分相近，是一种营养价值很高的优质蛋白。腰果蛋白具有其他动、植物蛋白无可比拟的营养价值，目前国内外对于腰果加工还停留在初级阶段，关于腰果的研究主要集中在腰果粉的物化性质、腰果仁油的提取分析及腰果仁分离蛋白和浓缩蛋白的功能性，蛋白抗原性等。食品工业中榨油后的腰果粕一般用于动物饲料，为了减少资源浪费，提高产品附加值，从腰果粕中提取蛋白质具有极大的实用意义。碱提酸沉法是蛋白提取的经典方法，已经成功运用于大豆、花生和油菜籽等蛋白的提取，盐提法提取蛋白条件温和，在保证提取率的同时能较大程度保持蛋白活性。

　　来自南昌大学食品科学与技术国家重点实验室的彭倩、颜小燕和李雨婷等结合腰果蛋白的特性，在前期钟俊桢等关于腰果蛋白提取工艺优化的研究基础上，选用碱提酸沉和盐提两种方法得到分离蛋白，对比分析蛋白微观结构变化对功能性质的影响，以期为腰果蛋白加工及新产品的开发提供理论依据。

　　两种方法提取腰果蛋白的微观形貌

　　DCNF（腰果脱脂粉）有明显的簇状球形蛋白，分子直径约为4 μm；CNSPI（盐提腰果蛋白）颗粒较小，形状不规则，部分蛋白质出现团聚现象，表面凹凸不平；CNPI（碱提酸沉腰果蛋白）呈现较大的片状结构，无球状结构出现，表面较平整。

　　表面疏水性分析结果

　　CNPI的H0为2 171.00，显著高于CNSPI（1 706.11）（P＜0.05），DCNF的H0最低，仅为1 592.25。

　　SDS-PAGE分析结果

　　在非还原条件下，所有的条带都表现出很高的相似性，蛋白质分子质量在19～53 kD之间，出现了7 个主要条带。分子质量分别为19、21、32、34、40、45、53 kD，其中53 kD的条带浓度最大，加入β-巯基乙醇后，蛋白质的亚基分布发生了变化，40、45 kD的条带消失，在原来的基础上新增了23、24、26、27 kD 4 条小分子条带，53 kD条带的浓度明显变小，而21 kD和32 kD的条带明显加深，这是因为53 kD的肽链断开了二硫键，形成了两条分子质量分别为21 kD和32 kD的条带。

　　氨基酸分析结果

　　以FAO/WHO/UNU推荐儿童和成人标准作为参照，脱脂粉与分离蛋白的氨基酸组成表现出明显差异，DCNF各种氨基酸含量普遍偏低，CNPI和CNSPI的必需氨基酸含量较高，缬氨酸、异亮氨酸含量都能达到儿童标准，芳香族氨基酸、含硫氨基酸、亮氨酸和苏氨酸含量能满足成人需求，而DCNF中必需氨基酸含量仅能满足成人需求。谷氨酸、天冬氨酸和精氨酸占腰果蛋白氨基酸比例较高，这与许多植物种子储藏蛋白一致，赖氨酸是腰果蛋白的第一限制性氨基酸。从氨基酸含量来看，两种方法提取的腰果蛋白无明显差异，进一步说明提取方法不会对蛋白质组成造成显著影响。

　　腰果蛋白二级结构分析结果

　　以研究较为成熟的市售大豆分离蛋白（SPI）作为对照，实验结果表明CNPI的二级结构由11.9% α-螺旋、35.0%的β-折叠、23.8%的β-转角和29.3%的无规卷曲组成，而CNSPI的α-螺旋含量高于CNPI，为15.8%，β-折叠含量为34.9%，与CNPI相当，β-转角和无规卷曲含量分别为22.3%和27.0%。实验数据表明β-折叠和无规卷曲是腰果蛋白的主要二级结构。与CNSPI相比酸碱处理后的CNPI在α-螺旋含量上呈显著性降低（P＜0.05），无规卷曲含量呈显著性升高（P＜0.05）。

　　腰果蛋白溶解度测定结果

　　在pH 3～9之间，CNPI和CNSPI的溶解度呈“V”型曲线，CNPI和CNSPI的溶解度在pH 5.0左右都达到最小值，分别为4.02%和1.12%。CNSPI在pH 3和pH 9附近几乎接近完全溶解，pH 3时溶解度高达98.10%，在酸性环境中的溶解度优于碱性；CNPI在pH 10时获得最大溶解度为70.42%，低于CNSPI，但在中性pH值下CNPI的溶解度显著高于CNSPI（P＜0.05），分别为35.36%和25.85%。

　　腰果蛋白功能性质测定结果

　　中性条件下BSA起泡性为249.00%，远高于CNPI（119.00%）、CNSPI（89.70%）和DCN（23.33%）。起泡稳定性是由蛋白质溶液的流变学性质决定的，BSA的起泡稳定性最好，为169.00%，CNPI的起泡稳定性为86.70%，显著高于CNSPI（60.00%）（P＜0.05）。

　　腰果蛋白乳化性及乳化稳定性测定

　　用不同方法提取的腰果蛋白在中性环境下的乳化性和乳化稳定性具有显著性差异（P＜0.05），CNSPI表现出显著较高的乳化性（30.14 m2/g），显著高于CNPI（20.21 m2/g）和BSA（22.67 m2/g）（P＜0.05）。CNSPI乳化稳定性最好，可达138 min，其次是CNPI，乳化稳定性为61 min，均远高于BSA的乳化稳定性（27 min）（P＜0.05）。

　　结 论

　　CNPI和CNSPI在结构、微观形态、功能性质和营养价值等方面有明显差异，CNSPI蛋白含量较高，溶解性和乳化性也优于CNPI，CNPI表现出较好的起泡性。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明两种提取方法对分离蛋白的亚基组成没有显著影响；本研究使用氨基酸分析仪来测定分离蛋白的营养价值，结果表明两种方法提取的腰果蛋白氨基酸含量无明显差异，其营养价值都远高于腰果脱脂粉。表面疏水性测定结果表明CNPI的表面疏水性显著高于CNSPI。扫描电子显微镜结果表明CNSPI呈现出大量的片状微观结构，而CNPI呈现出少量球状和薄片结合成的不规则形状。圆二色光谱结果显示CNSPI和CNPI中主要二级结构是β-折叠，CNPI中有较多的无规卷曲，约占29.3%，CNSPI有较多的α-螺旋（27.0%）。在中性条件下，CNPI的起泡性为119.00%，CNSPI的乳化性达到30.14 m2/g。