目的基因的获取3

4、基因组文库的大小

一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。

N：克隆数目

P：设定的概率值（如：0．99）

x：插入片段平均大小（15～20kb）

y：植物基因组大小（以kb计）

如果插入片段平均大小为 20 kb 某植物基因组大小为 4 x 106bp，P=0.99时，根据上式 N≈1 ×105。

含 1×105个克隆的基因文库相当覆盖了 5倍的基因组，在片段随机分布时，从文库中找到任一序列的概率不低于0.99。

（二）cDNA文库

1、概念

cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增。

2、cDNA文库的特点

（1）不含内含子序列。

（2）可以在细菌中直接表达。

（3）包含了所有编码蛋白质的基因。

（4）比DNA文库小的多，容易构建。

3、构建

cDNA文库构建共分四步：

①细胞总RNA提取并分离纯化出mRNA；

②合成cDNA第一链；

③将mRNA－DNA杂交分子转变成双链cDNA；

④双链cDNA重组到载体上。

前3步为cDNA合成，第④步为cDNA克隆。

举例：

定向cDNA克隆的方法。(a)早期的策略，其中环的形成是用来在双链cDNA的开放末端放置一个特异性接头(在此例中为Sal I的)的。连接之后，环经切割并用S1核酸酶处理，再将EcoR I接头加到两个末端上。用EcoR I和Sal I裂解可以产生一个限制性片段，该片段可以单向插入到经同样的酶切割后的载体中去。（b）一个近似的策略，但是第二条cDNA链的合成是随机引导的。用寡聚T引物延伸形成一个Sal I位点。在第二条链的合成中，这就形成一个双链化的Sal I接头。再向两个末端都加入另外的EcoR I接头，就使cDNA可以像上面所说的那样进行单向克隆。(c)Okayama和Berg的策略(1982)，其中mRNA在cDNA合成之前就在cDNA尾巴辅助下单向连接到质粒克隆载体上