相对RTPCR:引物与竞争子比例的决定实验

试剂、试剂盒 双蒸水RT-PCR 缓冲液TaqDNA 聚合酶cDNAdNTP 混合物基因特异的正向引物基因特异的反向引物dCTP

仪器、耗材 PCR 仪 PCR 管Quantum RNA Universal 18S standards

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

去除 RNA 酶的双蒸水

10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKC1，15 mmol/LMgCl2)

2. 酶和酶缓冲液

Taq DNA 聚合酶（5U/ul)

3. 核酸和寡核苷酸

cDNA(来自方案 1)

dNTP 混合物（10 mmol/L, 包含所有四种 dNTP)

基因特异的正向引物（5umol/L)

基因特异的反向引物（5umol/L)

4. 放射性复合物

[a-32P]dCTP(10uCi/ul)(1Ci=37 GBq)

5. 实验器材

Quantum RNA Universal 18S standards(Ambion; 包括 18SPCR 引物对和 18SPCR 竞争子）

薄壁的 PCR 管

6. 专用仪器

可编程的 PCR 仪

二、方法

1.引物与竞争子的比例如下。

2.在冰上准备 PCR 反应混合物 。

cDNA                                             5.5ul

10XRT-PCR 缓冲液                       27.5ul

10 mmol/LdNTP 混合物                 22ul

5U/ulTaqDNA 聚合酶                     1.4ul

去除 RNA 酶的 ddH2O                   177ul

[a-32P]dCTP(10uCi/ul)                   2.5ul

3.平均在每个 PCR 管中加入 42ulPCR 反应混合物，共 5 管，分别标记 1~5。

4.在 1~4 管中，分别在每个管中加 2ul 基因特异的正向引物（5umol/L) 和 2ul 基因特异的反向引物（5umol/L)。

5.如下所示加入 18SrRNA 引物和竞争子的混合物。

在 2 号管中加入 1:9 混合物 4ul

在 3 号管中加入 2:8 混合物 4ul

在 4 号、5 号管中加入 3:7 混合物 4ul

6.进行 PCR 扩增，如方案 1 所述，使用扩增线性范围决定的最佳循环数。

7.如方案 1 所述，用变性凝胶电泳来分析实验结果。检测哪一个泳道的 18SrRNA 产物的量最接近基因特异性产物的表达量，这一样品中引物与竞争子的比例在后续的相对 RT-PCR 实验中使用。