真核细胞基因组DNA的提取

实验概要

高等动物，高等植物的基因组相当庞大，如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，果蝇基因组有1.4×10⁸个碱基对，水稻基因组有1.4×10⁹个碱基对。真核细胞基因组中，约1万－1.5万个可表达的结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度高-不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好-以便有足够量用于分析；基因组相对完整-断裂的基因组以便用于以后PCR分析，RFLP分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。
本实验以幼嫩的植物材料为试材，介绍了真核细胞基因组DNA提取的流程，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出DNA。

主要试剂

液氮
CTAB抽提缓冲液：2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵) ，1%β-巯基乙醇 1.4mol/L Nacl，20mmol/L EDTA，100mmol/L Tris-HCl pH8.0
3M NaAC
50mM Tris-HCl pH8.0
20mM EDTA
氯仿：异戊醇(24:1)
异丙醇

70％乙醇

TE buffer

主要设备

瓷研钵

剪刀

高速离心机

离心管

实验材料

幼嫩的植物材料0.5g左右。

实验步骤

1. 取0.5g植物材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干。
2. 植物材料剪成25px左右碎片，放入预冷的瓷研钵中。
3. 加入液氮速冷，研磨成细粉(越细越好)。
4. 在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5ml，60℃保温1小时。
5. 15000rpm，离心10分钟。上清转入另一个新的离心管中。
6. 加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)，混匀抽提至水乳胶融状。
7. 15000rpm，离心10分钟。
8. 上清转入另一个新的离心管中。
9. 加入2/3倍体积预冷异丙醇，-20℃保温30min-1hr，缓缓混匀DNA成絮状折出。
10. 15000rpm，离心10分钟，弃上清。
11. DNA沉淀用 70％乙醇洗2次。
12. 加入400μl TE buffer溶解DNA。

注意事项

由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。