真菌总RNA的制备

试剂、试剂盒 酚氯仿异戊醇 12mol L 氯化锂 3mol L 乙酸钠 乙醇 DEPC 处理的水

仪器、耗材 水浴 低温高速离心机

实验步骤

一 材料与设备

1) 酚：氯仿：异戊醇 (25：24:1)。

2) 氯仿：异戊醇 (2：1)

3)12mol/L 氯化锂。

4)3mol/L 乙酸钠。

5)70% 乙醇。

6)DEPC 处理的水

7) 水浴。

8) 低温高速离心机。

二 操作方法

1) 在装有液氮的研钵中研磨 2〜5 g 真菌组织，直至完全变成粉末。

2) 把研磨好的粉末转移到 Falcon 管中，管中装有提取缓冲液 (每克真菌用 3 mL 提取缓冲液）及等体积酚：氯仿：异戊醇 (预热到 65℃）

3) 振摇试管以彻底混合。

4) 把混合物转移到一个无 RNase 的离心管中，以 13000〜18000 g 于 4℃ 离心30 min

5) 收集上层水相，加入等体积的氯仿：异戊醇 (24:1)，翻转混匀。

6) 以 1300〜18000 g 于 4°C 离心 30 min。

7) 收集上层水相，加入 12mol/L 氯化锂至终浓度髙于 2mol/L。

8) 混合后于 4℃ 过夜以沉淀 RNA,

9) 以 13000〜18000 g 于 4℃ 离心 30 min

10) 去上淸，以 5 ml3mol/L 乙酸钠 (pH5.2) 清洗沉淀，按第 9) 步离心 15 min

11) 去上清. 以 20 ml70% 乙醇清洗沉淀，再按第 9) 步离心 I5 min。

12) 用 70% 乙醇重复冼涤一次。

13) 真空干燥以去除乙醇，

14) 以适当体积（250〜lOOOul)DEPC 处理的水溶解沉淀。

15) 溶解的 RNA 于-70°C 保存。

注意事项

1) 将研磨好的真菌转移到 Falcon 管中时，要小心操作以避免损失. 所有操作都应该迅速，样品/试管尽暈放在冰上以降低 RMase 的作用。

2)65℃ 加热可帮助 RNA 溶解。如果有不溶颗粒，可于 13000〜18000 g 离心 2 min, 收集上清，沉淀中部分或极少含有 RNA 或不含RNA.