稳转株即稳定表达细胞株,指的是基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。慢病毒感染-药物筛选法是目前广泛应用的稳转株构建方法,具有高效整合、目标细胞广泛等特点。
一.准备及预实验
确定细胞系相关信息,需包括如下内容
目标细胞系培养条件
目标细胞增殖速度
支原体污染情况
注:为避免慢病毒感染后细胞死亡,务必保证细胞无支原体污染!
预实验确定MOI值
查阅文献确定慢病毒在目标细胞系中的MOI;
参考查阅得到的数据,设计梯度实验,摸索最适MOI。
预实验确定筛选药物用量:
查阅Puromycin/Blastincidin等在目标细胞系中稳转株筛选的致死用量信息;
参考查阅得到的数据,确定3个药物浓度梯度(如没有相关信息,则需将药物浓度梯度范围增大,数量增多至6个);
Day0将细胞铺于6孔板中,使Day1细胞融合度约90%;
Day1按(2)中设置的药物梯度,加入药物;
Day4换液,并重新加入药物;
Day7观察,找到致死率100%的孔,该孔使用的药物浓度,即为药物筛选浓度。
附1:经验筛选药物用量
二.稳转株筛选及构建
注:以下实验参数,按1株稳转株为例描述,实验需考虑有无对照稳转株!
细胞铺板:
将细胞接种于6孔板中(4个孔),使次日细胞融合度约70%
病毒感染:
根据预实验确定的MOI值,计算慢病毒体积,添加慢病毒(每孔添加ADV-HR 2μL);
换液:
慢病毒感染次日,将细胞进行换液处理;
观察感染效率:
感染后72小时,观察感染效率,效率最低不应低于40%。
筛选:
多克隆稳转株:从感染72小时后开始于6孔板中加筛选药物,每隔2天,重新换液加入药物。药物筛选需至少持续14天,直至显微镜下观察荧光细胞比例为100%。
注:第一次加入药物时在上午进行,4-6小时后观察细胞状态,如细胞死亡过多,需更换新鲜不含药物的培养基。
附2:多克隆稳转株
多克隆稳转株的荧光通常强弱夹杂。
单克隆稳转株:建立在获得多克隆稳转株基础上
有限稀释法:
取24个1.5毫升EP管,每管中加入800微升完全培养基;
用胰酶将多克隆稳转株消化(90%融合度,10毫升培养基终止消化),取80微升至第一个EP管中,混合均匀;
注:应使用1000微升枪尖,混合时不要过度吸打,以免破坏细胞。
从第一个EP管中取80微升至第二个EP管中,混合均匀,以此类推。
将EP管中的细胞悬液,以每孔100微升,接种于96孔板中;
过夜培养后,观察第12-24列,寻找只含有1个细胞的孔,并做好标记;
培养3-4周,待标记孔中细胞扩增后,消化传代扩增,即为单克隆稳转株细胞。
注:培养的第一周不要换液,接下来每3-4天换液。
平板挑取法
计数100个多克隆稳转株细胞,接种于一个10cm培养盘中;
注:尽量吹打均匀,防止细胞聚团。
过夜培养后,观察并寻找单个细胞的位置,并在盘底做标记;
培养培养2周;
注:培养的第一周不要换液,接下来每3-4天换液。
待标记处的细胞扩增为肉眼可见的白点,在移液器尖端吸取一点胰酶,缓慢滴至细胞处,待细胞消化后,迅速吹打,将消化下的细胞转移至96孔板中,传代扩增,即为单克隆稳转株细胞。约需2-3周的时间。
注:每盘选取20个为宜,在消化时,需按照先消化边缘的,再消化中心的原则,防止克隆之间的相互污染。培养的第一周不要换液,接下来每3-4天换液。
附3:单克隆稳转株
单克隆稳转株的荧光强度基本一致。
三、稳转株构建中的常见问题
1.支原体污染问题
由于轻度的支原体污染并不影响细胞的生长和增殖,故被许多实验室所忽略。但支原体易在病毒感染细胞后爆发,出现大量细胞碎片,甚至导致细胞死亡,导致稳转株筛选的失败。我们建议在稳转株构建之初,务必排除细胞及培养环境中的支原体污染。
2. 其他问题
除支原体污染之外,还有以下问题会经常出现于稳转株构建中。
记忆性B细胞(MemoryBcells,MBCs)能够对感染性疾病提供长效的免疫保护,然而,HIV、丙型肝炎和巨细胞病毒等慢性病毒感染会破坏MBC的发育和抗体的产生[1],导致不完全和无效的免疫保护。......
哺乳动物复杂性状的性别差异是普遍存在的,并且与雄激素密切相关。然而,性别差异的分子和细胞特征及其雄激素的调节仍然缺乏。 2024年4月10日,中国科学院分子细胞科学卓越创新中心(分子细胞卓越......
中国最有名的猴子,除了孙悟空外,大概就是“中中”“华华”了。2018年初,这两只小猴睁着懵懂的大眼睛,登上国际期刊《细胞》封面,成了举世瞩目的大明星。作为全球首例体细胞克隆猴,它们的诞生开启了实验动物......
“赶巧了,实际上这两项工作我们‘磨’了很多年了。”近日接受《中国科学报》采访时,提及一个月内在《细胞》和《自然》连发论文,中国科学院分子植物科学卓越创新中心研究员张余一语道出科研背后的艰辛。过去十几年......
大家好!来一起关注上午的市场行情及最新资讯~5月8日,A股市场小幅低开后震荡下行,截至上午10时56分,深证成指、创业板指跌幅有所扩大。行业板块上,上午医药、农业、银行等板块表现居前,煤炭股盘中走高;......
一轮凶猛疫情肆虐多国。据央视新闻,巴西卫生部公布最新数据显示,巴西2024年登革热疑似及确诊病例上升至4270624例,死亡病例2197例,另有2276名死亡病例待核查。另据西班牙媒体《20分钟》报道......
近日,《柳叶刀—全球健康》发表了一项由南京医科大学李有教授团队和王昕副教授团队合作开展有关中国呼吸道合胞病毒的研究。研究提示,各省的呼吸道合胞病毒(RSV,以下简称合胞病毒)季节持续时间存在明显差异,......
美国莫菲特癌症中心科学家一项新研究提出,细胞拥有一个此前未知的、独立于基因组的信息处理系统,使它们能够对环境变化迅速作出反应。相关论文发表于最近的《交叉科学》(iScience)杂志。图片来源:《交叉......
γδT细胞是一种独特的T细胞亚群,在各种免疫反应和免疫病理中起着至关重要的作用。近日,暨南大学生物医学转化研究院研究员杨美香与教授尹芝南团队合作,在γδT细胞代谢调控研究方面取得重要进展,他们揭示了免......
4月25日,中国科学院生物物理研究所研究员丁璟珒研究组和北京生命科学研究所资深研究员邵峰团队,在《科学》杂志在线发表研究论文,揭示了两种来源于低等真核生物的gasdermin(GSDM)蛋白通过非蛋白......