研究建立植物高效引导编辑设计策略

　　实现重要农作物精准基因组编辑对加快农作物遗传改良进程具有重要意义。引导编辑技术（Prime Editing）能够在基因组的靶位点处实现精准的片段插入、删除及碱基的任意替换。引导编辑系统由两部分构成：一部分是nCas9(H840A)与工程化改造的逆转录酶（Reverse Transcriptase， RT）融合构成的PE效应蛋白；另一部分是包含PBS（Primer Binding Site）序列和RT模板（RT Template）序列的pegRNA（Prime Editing Guide RNA）。在pegRNA的引导下，PE效应蛋白结合到靶位点，切割非靶标链产生缺刻，释放出可与其PBS序列结合的游离单链，从而起始对RT模板的逆转录过程，通过DNA修复将RT模板上对应的碱基改变引入基因组。中国科学院遗传与发育生物学研究所研究员高彩霞课题组前期在水稻和小麦中建立并优化了适用于植物的引导编辑器（Plant Prime Editor， PPE）（Lin et al.， Natrue Biotechnology， 2020）。目前的研究发现，引导编辑系统在植物基因组中一些位点编辑效率依旧偏低，需进一步优化。该课题组前期工作暗示植物引导编辑效率可能受到PBS和RT模板序列的影响（Lin et al.， Natrue Biotechnology， 2020）。设计合适的pegRNA序列是提高引导编辑效率有效路径，但通过常规实验方法筛选高效形式的pegRNA费时费力，限制了引导编辑技术在植物中的广泛应用。因此，如何提升引导编辑效率并快速获取高效形式的pegRNA是植物引导编辑技术亟须解决的问题。

　　近日，高彩霞课题组与遗传发育所研究员李家洋课题组合作，开发出高效设计pegRNA及提高植物引导编辑效率的新策略。引导编辑系统的PBS序列与非靶标链结合是起始逆转录过程的重要条件，熔解温度（Melting Tempreture， Tm）决定两条链结合的紧密程度，因此，研究人员推测PBS的Tm值可能对引导编辑系统的编辑效率产生重要影响。对此，研究人员在18个水稻内源位点进行了测试，发现当PBS的Tm值为30℃左右时，水稻的引导编辑效率在多数位点上达到最高，且随温度的增高或降低均呈现递减的趋势。此外，研究人员还开发出双pegRNA的策略，即针对所需突变同时向细胞中递送分别靶向DNA两条链的两个pegRNA进行共同编辑，以期提高引导编辑的效率。在15个水稻内源位点测试了该策略，结果表明，采用双pegRNA的引导编辑与使用单个pegRNA相比编辑效率平均可提升3.0倍。