NC膜的选择
膜的选择涉及到一个膜的分类标准问题，一个供应商可能提供这个膜是8um，但另一个供应商告诉你膜是135s的。这之间的区别与联系是什么？
um指的是膜孔径，而从上面膜的生产过程，我们可以看出，膜的孔径实际上是没有办法界定的。由于干燥成型等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的.膜孔径的说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼.而以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是***s.该单位已经越来越被各大厂商所接受，成为了一个通用的比较标准.以下我们将采用s单位来进行交流。
换算情况大致为：8um=135s；6um=180s
不同秒数的膜对反应有什么影响呢？首先，我们分析一下液体在膜上的运动过程。一张长度为4cm的膜， 每隔1cm做一个标记， 当液体运动过标记处时记录时间点. 那么你将会发现液体在膜上的运动是呈减速前行的。而两张不同秒数的膜（例如135s， 180s）在同一时间标记点处的运动速度不同.这个试验用清水做不好观察，可以考虑用色素水溶液，非常明显。
那么从这个试验可以看出，在通过同一T线喷点位置时，金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜。那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡。
其实我们并没有那么多选择。经过使用实践，各供应商一般都只提供两个型号，就是135s和180s。 虽然看到有些厂家的产品目录上型号种类繁多，但这两个型号的定货量就占了95%以上，其他型号供货上也就远不如这两个型号来得顺利。135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法. 你所要做的是，先选择其中的一个型号， 然后比较不同供应商同一个型号的差异，由于前面说的添加配方与你的试验条件配合的不同，这个差异可能大也可能小。具体要根据试验结果来确定最后的选择。我个人不建议地毯式的测试不同规格/不同厂家的膜，这样成本高，成功的几率也小。
膜的质控方式
本节适合用膜量较大的公司用户参考。对于一卷膜可以用上几个月的用户来说，厂家的质控标准已经完全能满足你的要求，而不需要自己再做相关的质控。
膜的质控虽属于原辅料QC职能，但由于其专业性强，一般都由小样调试人员来执行。膜入原料库后需要进行如下检验工作：
1. 查收COA
在购买时， 供应商会随产品为每个lot的膜提供一张纸质的出厂质量证书， 该证书被称为COA。如果你已经购买某一批次的膜， 而没有索取相应的证书， 如果有需要可提供批号向厂家要求补发。其实在很多行业都有厂商为自己的产品附上COA的习惯。
COA一般只提供给大客户， 对小客户是没有意义的。其内容主要是厂家在产品出厂时做过一些测试的罗列。作用可以理解为质量凭证和测试数据参考。
2. 检查物理性能
膜的物理性能主要是2个参数， 膜厚度和宽度。长度不需要检测。使用中可以关注长度上是否有断面重接现象， 断面多费料则多， 少数发生。厚度，由螺旋测微尺，选择几个测量点检测后算平均。膜生产的必测参数。主要表现为厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的C/T线宽窄不一，另外也影响爬速。宽度，普通直尺测量。物理性能一般都不会有什么大问题。毕竟检测标准客观，易把握。没有条件执行的厂家可省略。
3. 跑水性能
样本采用含有有色食用色素的水溶液，目的是容易观测，需制作一个简易支架。
操作：注入足够溶液到下部槽内，将不同批次膜每隔1cm做一次标记（总长大于4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。
4. 点样测试
C/T线出线时间，其他试验条件相同情况下，记录和比较C/T线出现时间是否与对照有差异。
灵敏度，比较不同样本浓度情况下，T线的变化是否和对照组同。一般每批次膜取前端一段用来测试即可。由于制造过程的不均一性， 不同批号的灵敏度会有一定差异，当大批量使用时，这种差异影响是非常大的，那么就要按照灵敏度表现将不同批号的膜进行分类。在膜的STOCK中要能够轻易的分辨出来。当进入后期生产调用时，就能根据这些分类，按照订单要求取用不同批号的膜，或者用强灵敏度的原料和差灵敏度的膜来搭配。
关于膜的批内差。批内差是肯定存在的，只是差距大小的问题，依据一般的测试条件是很困难获得详细的数值，因为你不可能对每一卷膜的每一段都做详细的测试。减小膜批内差的最有效方法是不购入边缘膜带。前面说过膜的生产方式，生产出的半成品是宽幅很大的一个膜面，要通过截面裁切才能获得25mm或者20mm的宽度。那么就有中间部分，和边缘部分之分.越靠近中间部分，膜的均匀性越好，边缘部分则相对要差，就造成了批内差。一般可以通过COA获得具体位置信息，例如MILLIPORE就在切割后用字母A，B，C……来表示切出的窄膜在宽幅膜中的位置。
如果是试用某个型号的膜小样，还需要在以上检测后加入膜加速老化试验，包括膜单独的老化试验和点好膜后产品的老化试验， 具体试验方法请参看我以前写的研发思路一文。
膜的深入探讨和应用技巧
从本节开始，我们开始对膜进行深入讨论和谈一些应用技巧。
1. 蛋白与膜的结合原理
蛋白与膜的结合原理， 已知的结合力包括疏水作用力\H键\静电作用力等，确切的结合原理并不明确，主要靠假说来支撑。主要有两种假说：
1）首先两者靠静电作用力结合，然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合。
2）首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长时间结合。
两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性，导致在这方面的工作非常依赖实践经验。
2. 膜对结合的影响
1）膜孔径
有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜，但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品，如果是不同厂家的产品，这种比较是无意义的。膜孔径与层析速度的关系，已在上文描述。随着膜孔径减小，膜的实际可用表面积递增，膜结合蛋白的量也递增。 估量表面积的参数为表面积比率（实际可用表面积与所用膜平面积的比率）。
另外，膜孔径越小，层析速度也越小，那么金标复合物通过T线的时间也就越长，反应也就越充分。
综合以上两点，结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性越高.所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点。
2）不同厂家的膜差异
这个差异主要来源于两点：
①生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源，类型，数量不同。同理，在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响。 ②处理过程不同。
3. 生物原料，缓冲溶液的试剂和配方
1）生物原料， 作为CT线的生物原料使用情况各异，所以这里只做略述。
首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体，主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点，而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别，毫无疑问就增加了优化难度。其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上。
2）缓冲液
大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方，包括缓冲液，封闭液等等处理溶液配方。
其实我也无法提供给你一个万用配方清单。因为不同的反应体系需要不同的配方来支持， 而不同机构的反应体系又有差异。想获”鱼”先学”渔”.。为了不误导大家，我在下面涉及到配方的问题上，仅提供思路，具体配方请自己摸索。
缓冲液的构成一般是：PBS（或其他缓冲体系）+作用物质（针对某一特定问题）+PH调整. 我在参考过以前的各种资料后，个人意见为配方原则为宜简不宜繁，根据自己的需要添加作用物质，原来的很多需要添加的作用物质，由于膜制造技术的改进已经不再需要。
推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2， 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。
作用物质的情况大致罗列如下：
少量NACL，减少信号强度，消假阳。
有机醇（甲醇，异丙醇等），润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。个人不推荐，因制膜工艺改进。
表面活性剂（TW20，TX100），增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色。
糖，保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力同上。
调PH到某个位置，可以消假阳。
4. 点样环境
环境湿度对点膜过程非常重要。最佳湿度一般在45-65%。湿度过低，膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试会出现疏水斑。湿度过高，膜上毛细作用加强，点膜容易引起CT线变宽甚至扩散。为了保证点样时膜湿度的均一性，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。
5. 点样仪器与膜面情况的关系
目前有两种点样方式，划膜式和非接触点膜式.非接触点膜式优于划膜式，进口划膜式优于国产划膜式。
因划膜式为软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，划管会在其表面留下印痕.进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好，所以留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留下的划痕也就比较严重。 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导致假阳性。 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线（鬼线），而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象。
6. 膜的宽度与点样位置
膜的宽度一般有18mm（or 20mm）和25mm两种， 分别使用在做测试条和做测试板上。然而，不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度。点样位置上移，金标复合物通过T线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高。反之灵敏度降低。这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性。
7. 溶液在膜上的扩散
溶液在膜上的点样量一般情况下为1ml/cm。溶液在膜上的扩散是趋向两端的，喷点上去的是均匀的抗体溶液，但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会不断向两边扩散，所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的。一般情况下不影响你的试验。如果你发现线条出现两端红，中间淡的现象，就要考虑这个问题了。可以加如上面说的作用物质来解决。