硫氧还原蛋白融合蛋白的表达和纯化实验

融合蛋白

氨苄青霉素 甘油 色氨酸

电泳仪 培养箱 摇床 试管

1.  将编码目的序列的DNA片段克隆于pTRXFUS或hpTRXFUS质粒上的trxA基因3‘末端，构建符合读框的融合基因，或者于pALtrxA-781的单一Rsr 2位点上插入短肽编码序列。

2.  用含有重组硫氧还蛋白融合蛋白的质粒的连接混合液，转化感受态GI724细胞。转化的细胞种入含100 μg/ml 氨苄青霉素的IMC培养皿选择转化子，把培养皿放在30℃对流培养箱中温育，直到出现菌落。

3.  候选菌落接种于5 ml CAA/甘油/氨苄青霉素100培养液中于30℃温育过夜。小量制备质粒DNA，用限制性酶切作图检査基因是否正确插入pTRXFUS。

4.  对候选克隆的质粒DNA进行测序，以确证硫氧还蛋白与待研究基因或序列间的连接 区域。

5.  将冻存的含硫氧还蛋白表达质粒的GI724菌划线接种到含100 μg/ml 氨苄青霉素的IMC培养基上，以长出单菌落。于30℃生长20 h。
 

6.  从平皿中挑取新长起来的、分离较好的菌落，接种18 mm×150 mm 培养管内的5 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的IMC培养基中。在摇床上于50℃温育过夜。

7.  取0.5 ml 过夜培养物，接种于250 ml 培养瓶内的50 ml 含100 μg/ml 氨苄青霉素的新鲜IMC培养基中。于30℃充分通气培养，直到其550 nm 吸收值达到0.4~0.6 OD/ml。

8.  从培养物（未诱导的细胞）中取出1 ml 的一小管。在550 nm 处测量吸收值，当密度达 到0.4~0.6 OD/ml 时，于室温以最大速度微量离心1 min，收获细胞。用吸液管小心吸去全部用过的培养基，将细胞团块保存于-80℃。

9.  立即向剩余的细胞中加入0.5 ml 10 mg/ml 的色氨酸（使终浓度达到100 μg/ml），以诱导P_L的转录。

10.  37℃温育4 h。在此期间，每间隔1小时取出1 ml 的小份培养物，按步骤8收获细胞。

11.  诱导后4 h，于4℃以3 000 r/min 离心（例如，使用Becjman J6转子）10 min，从培养物中收获剩余的细胞。于-80℃保存细胞面块。

12.  用SDS-PAGE样品缓冲液重悬诱导期间得到的细胞团块（得自歩骤8和10），加量为200 μl/OD₅₅₀细胞。于70℃加热5 min，以完全裂解细胞并使蛋白质变性。 
 

13.  在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，每条泳道加入相当于0.15 OD₆₅₀细胞的样品，凝胶用考马斯亮蓝染色1 h。使凝胶脱色，检查表达情况。