硫酸铵沉淀法浓缩蛋白质实验——硫酸铵沉淀法

当高浓度盐存在时，蛋白质往往凝聚并析出沉淀。这一技术称为「盐析」。不同的蛋白质在不同浓度的盐中形成沉淀，所以盐析常用于蛋白质的分离纯化。几种因素如 pH 、温度、蛋白质纯度在测定各种蛋白质的盐析时起着重要作用。

选择硫酸铵是因为它具有一些优良性质，如盐析的有效性、pH 范围广、溶解度高、溶液散热少和经济适用。

硫酸铵浓度常以百分浓度表示，以 X％ 表示所需配制的溶液浓度，表示开始的溶液浓度，所需的硫酸铵克数按以下公式计箅：

g＝515（X－X₀）/（100－0.27X）

大多数蛋白质在 55％ 硫酸铵中沉淀，获得最大量蛋白质沉淀是 85％ 硫酸铵溶液，以不含硫酸铵的 100 ml 蛋白质溶液为起始溶液。

蛋白质溶液

硫酸铵用于悬浮沉淀物的缓冲液

烧杯磁力搅拌器和搅拌子离心机和转头

1. 将盛有蛋白质溶液的烧杯放在装另一装有冰水的大烧杯内，并置于磁力搅拌器上搅拌；

2. 边搅拌，边徐徐加入 56.8 g 硫酸铵至饱和，该步骤应在 5～10 min 内完成；

3. 继续搅拌 10～30 min；

4. 10 000×g 离心 10 min 或 3000×g 30 min；

5. 弃去上清液。将沉淀悬浮于 1～2 倍沉淀物体积的缓冲液中，残留的不溶性物质可能是变性蛋白，通过离心除去；

6. 硫酸铵能够通过透析，超滤或脱盐柱除去。

1. 搅拌必须是有规则的和温和的。搅拌太快将引起蛋白质变性，其变性特征是起泡。用磁力搅拌器不明显产热，这一点也很重要。

2. 大多数蛋白质在盐溶解后的前 20 min 沉淀，一些蛋白质要经数小时才能完全沉淀。

3. 为了平衡硫酸铵溶解时产生的轻微酸化作用，沉淀反应至少应在 50 mmol/L 缓冲液中进行。

4. 缓冲液应含有鳌合剂如 EDTA 以除去硫酸铵中微量的重金属离子，因为这些离子对目的蛋白质是有害的。

5. 为确保获得最大量沉淀，使用蛋白质初始浓度至少为 1mg/ml。

6. 硫酸铵沉淀反应通常是贮存和稳定蛋白质的良好方法。

7. 少数蛋白质在硫酸铵浓度低于 24％ 时就产生沉淀，而大多数要在 80％ 以上才能沉淀。在纯化的初始阶段，常利用蛋白质在硫酸铵中溶解度的差异分离蛋白质。硫酸铵沉淀可除去 RNA 和 DNA。

8. 在蛋白质的等电点其溶解度降低，在此条件下，静电的相互作用可导致蛋白质凝聚和沉淀在蛋白质的等电点，低浓度的硫酸铵就能沉淀蛋白质。

9. 在蛋白质结晶实验中，采用硫酸铵沉淀十分有效。