磁珠法提取乙醇固定样品DNA

实验概要

本实验利用磁珠法分别从乙醇固定四年的小鱼和乙醇固定的毛蚝组织提取DNA。

实验原理

在实际的研究工作中，野外取样的地点一旦较为偏远，受条件的限制，很难保证得到的样品活体或能够快速冷冻；另外，对一些稀有物种和濒危种，鲜活样品的采集十分困难，一般为了解决这些问题，常采用乙醇和甲醛固定的方法来处理样品，再对样品DNA 进行提取以及扩增。使用乙醇固定样品具有硬化，固定，脱水作用，对组织渗透迅速，特别适合组织中核酸的保存，相比于甲醛等其它固定方法，此法更简单，保存时间更长质量更好，也更加清洁无害。乙醇固定样品主要应用于水产种质资源鉴定，医院或兽医病理样品保存，法医样品保存等方面，在特定物种基因保护，生物多样性，动物分子标记，司法鉴定等方面有广泛的应用。

Omega Bio-Tek 相应试剂盒既能够快速有效的抽提得到乙醇保存多年的样品基因组DNA，又可以利用直接PCR 系统，快速的对乙醇保存样品进行PCR 鉴定，为您的研究提供最有力的工具。

主要设备

KINGFISHER FLEX 自动化仪器(Thermo scientific 公司)

实验材料

乙醇固定四年的小鱼
乙醇固定的毛蚝组织

实验步骤

1. 样品预处理：

    1) 用镊子将乙醇固定样品从乙醇中取出，吸水纸轻轻吸干乙醇后将样品放在AT4 中浸泡10 分钟；

    2) 用吸水纸轻轻吸干样品的AT4后将样品剪碎，称取2mg-10mg样品量加入180ul TL Buffer 和20ulProteinase K 混匀，55℃水浴消化1-3hours 至物呈颗粒状样品为止，期间混匀3-4 次；

    3) 加入5ul RNase A 室温放置15-20 分钟，期间混匀3 次。

2. 加样：

    1) Plate 1：200ul 样品消化液 500ul lysis buffer 3;

    2) Plate 2：700ul PHB Buffer;

    3) Plate 3：700ul PHB Buffer;

    4) Plate 4：700ul 70% Ethanol;

    5) Plate 5：700ul 70% Ethanol;

    6) Plate 6：50-80ul Elution Buffer；

    7) Plate 7：for tip。

3. KINGFISHER FLEX 仪器自动化程序设置：

    1) Pick-up from：Plate7；

    2) Mix：中速2min，在Plate 1 操作；

    3) Pause：加入40ul 磁珠，在Plate 1 操作;

    4) Mix：快速2min，中速2min，1 个循环，吸附磁珠，在Plate1 操作；

    5) Mix：中速1min，1 个循环，吸附磁珠，在Plate2 操作；

    6) Mix：中速1min，1 个循环，吸附磁珠，在Plate3 操作；

    7) Mix：中速1min，1 个循环，吸附磁珠，在Plate4 操作；

    8) Mix：中速1min，1 个循环，吸附磁珠，在Plate5 操作；

    9) Dry: 液面上干燥7min，Plate5 操作；

    10) Mix：预热，加热温度为65℃，快速2min，中速2min,3 个循环，吸附磁珠，在Plate6操作；

    11) 最后释放磁珠到Plate5 中；

    12) 操作完成，检测结果。