磁珠法核酸提取裂解液的作用原理

磁珠法核酸提取是以纳米生物磁珠为载体的一种新型核酸提取技术，核酸分子可与磁珠表面的硅羟基发生特异性识别与结合，在外部磁场的作用下发生聚集或分散，彻底摆脱传统核酸提取过程中离心、抽取上清液等手工操作流程，从而实现核酸的自动化提取。广泛应用于临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。

磁珠法核酸提取一般包括裂解、结合、洗涤、洗脱四个主要步骤，每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现，其中裂解环节是决定提取之质量的重中之重，经常也会有老师问到应该如何对裂解液进行优化。那么，我们就来分析一下配置裂解液经常用的试剂及其作用原理。

1、盐酸胍、尿素

盐酸胍在浓度为4-8mol时可断裂氢键，有两种可能机制：1、变性蛋白和盐酸胍、尿素优先结合，形成变性蛋白-变性剂复合物，当复合物被除去，引起N-D反应平衡向右移动，随着变性剂浓度增加，天然状态的蛋白不断转变为复合物，zui终导致蛋白质完全变性；2、盐酸胍、尿素对氨基酸具有增溶作用，能形成氢键，当浓度高时，能破坏水的氢键结构，成为非极性残基的较好溶剂，使蛋白质内部的疏水残基伸展和溶解性加强，盐酸胍、尿素引起的蛋白变性往往是不可逆的。

同时盐酸胍是一个核酸酶的强抑制剂，但并不是一种足够强的变性剂，可以允许完整的RNA从富含RNase的组织中提取出来。高浓度尿素同样可以使使蛋白质变性并抑制Rnase活性。

2、异硫氰酸胍

蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。在通常使用的蛋白质变性剂中作用zui强的是异硫氰酸胍，它们可以使多数蛋白质转换成一种随机的卷曲状态。含有强力的阴离子和阳离子基团，它们可以形成较强的氢键。在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而去垢剂，如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。

3、二硫苏糖醇（DTT）

二硫苏糖醇的主要作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键，使Rna酶变性，同时抑制酚类氧化引起的磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联。

二硫苏糖醇刺激性气味不大，毒性较低。由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差；但冷冻保存或在惰性气体中处理能够延长它的使用寿命。由于质子化的硫的亲核性较低，随着pH值的降低，DTT的有效还原性也随之降低；DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理。

4、蛋白酶K

一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。此酶经纯化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛，包括制备脉冲电泳的染色体DNA，蛋白质印迹以及去除DNA和RNA制备中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作浓度是50—100μg/ml。在较广的pH范围内（pH 4-12.5）均有活性。

以上是裂解液中常用的试剂，在实际操作中针对不同的样本（植物组织、动物组织、全血、血清、质粒）应配制不同浓度的裂解缓冲液，并根据样本的状态（质量、体积）及期望达到的实验结果（核酸的浓度、OD比值）对裂解液的浓度进行调整，此外，还要对结合、洗涤、洗脱三个步骤进行优化，从而得到较完美的核酸提取方案。