磷酸化位点分析实验磷酸化位点的确定

蛋白样品

过去确定磷酸化位点测序最常用的是逐步化学降解法，如丝氨酸和苏氨酸磷酸化分析方法、酪氨酸磷酸化分析方法, 最近，此方法已经主要被质谱方法所取代 。非放射活性和放射活性磷酸肽测序的方法，这两种方法可以补充．在某些情况下可以替代质谱方法来确定磷酸化位点。非放射活性方法是用于检测磷酸丝氨酸和磷酸苏氨胺，包括β-消除，与巯基乙醇反应形成s- 乙基化半胱氨酸或β-甲基-s-乙基半胱氨酸，它们很容易以 PTH 衍生物的形式从自动测序仪中提取出来。放射活性方法是由 Ceerenkov 计数检测器检测在 Edman 化学降解测序僻环中释放出的放射性活度。如果测丝氨酸或苏氨酸磷酸盐残基，磷酸盐被除去，可观察到³²p-磷酸盐和各自的 PTH衍生物。在酪氨酸磷酸盐情况下，磷酸酯键更稳定，分析的提取物是 PTH 磷酸酪氨酸。如果得到的磷酸肽的量非常有限，也许不可能用化学降解法测肽序列，但是在降解循环后，放射活性从肽中释放，通常有可能确定肽内磷酸化位点。