磷酸钙法转染HEK293T细胞

293T细胞

无菌水ddw NaCl KCl Na2HPO4 glucose HEPES CaCl2

Eppendorf管 培养皿 培养箱

1. 铺细胞： 选择状态良好的293T细胞传代， 2-3x10⁵个细胞/35mm dish。

2. 20-24h后，待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候，进行转染。下面就35mm dish为例，采用以下转染体系：

ddw： 105ul

plasmid： 2ug （如0.5ug/ul， 即用4ul）

2M CaCl2： 16.5ul

2XHBS： 125ul

按上述顺序，往eppendorf管中依次加入上述四种试剂。

先将前三者混匀， 最后加2XHBS。

一种方法是，加2XHBS时要逐滴加入， 吹打至微现乳白色， 立即均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。

另一种方法是， 加入2XHBS后立即吹打约40下（不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定， 建议做一个梯度实验，吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打）， 之后步骤同上， 立即均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。

1.HBSP 缓冲液的 pH 值在 6 .70 和 7 .10 时转染HEK 293T 细胞的效果不好 ,细胞成活率低， 有大颗粒状物体存在;pH 值在 6 .96 时转染效果好，细胞存活率高， 蓝染细胞明显。

2.未纯化的 lacZ-pShuttle 质粒转染 HEK 293T 细胞转染效率低， 细胞成活率很低，而纯化后的质粒转染效率高 ,蓝染细胞明显 。

1.转染后培养 6h 进行甘油休克效果最佳，比培养 0h 直接进行休克转染效率升高584.4 %。

2.甘油休克时间为4.5min 时转染效果最佳，比不用甘油休克转染效率升高 130.8 %。

3.来源于论文《一种用磷酸钙法高效转染 HEK 293T 细胞方法的建立》,陈晓,蒋捍东,路新枝,于文功。