神经元的电生理检测

实验概要

本部分将以大鼠脑片的神经元为例，描述神经元的电生理检测过程。本检测是利用玻璃微电极检测电流的方法，来测定单个神经元的电生理反应。

主要试剂

电极液

主要设备

玻璃微电极、显微镜、视频摄像系统、显微操作仪、膜片钳、电极holder。

实验材料

大鼠脑片的神经元

实验步骤

（1）将玻璃微电极固定在电动操作臂上。注意，充满液体后，玻璃电极中不能有气泡。液体的量以刚好浸没氯化银线的尖端为宜。拧紧操作臂的盖子，缓慢推动推电极，以避免电极尖端进入液面时挑起下面的灰尘。电极要位于视野中间，液面之上（低倍放大，如×5），然后慢调焦距，同时将电极缓缓浸入液体，直到尖端清晰为止。
（2）对空电极施加一个测试脉冲（如，5mV/10ms），用欧姆定律计算电极的电阻（适合的电阻值为3-5欧姆；大多数膜片钳配备的软件能自动计算该值）。将镜头移到待测物（此处是大鼠脑片），浸没镜头，并将其聚焦于电极尖端。依次放低待测物和电极，直到尖端刚好位于待测物的表面。
（3）转到荧光镜下，将感兴趣的细胞位于视野中间，在DIC模式下确认细胞。关闭荧光通路的shutter，用电极逐渐缓慢接近细胞，并持续施加正压力，直到细胞上出现一个小凹点。在示波器或电脑屏幕上观察测试脉冲下的反应，并改变正压，直至产生轻微的吸力。此时的反应应该保持不变，除了有轻微的峰值，出现在测试电压的起始和终止时。
（4）将电流归零，电压设为-80mV。这样能避免大量钙离子在穿破细胞的同时流入，致使细胞过去极化而死亡。逐渐增加吸力，同时在示波器或显示器上观察细胞反应，直至电流出现。该电流的出现源于给细胞本身，cell capacitance（Cm），需要用归零补偿。现在Cm，Rm和series resistance（Rs）的值都已被确定。
（5）稳定而持续的电流刚刚出现（＜100pA），开始记录。决定电流的因素，除了稳定与细胞紧密契合的电极之外，电极液的组成也极大的影响到电流的值。因此，要等待神经细胞中的细胞液和电极中的液体交换完成。根据不同的扩散速率，交换可能在几十至数百米内完成，等待数分钟是合适的。这个等待的时间间隙还能保证，让组织中泄漏的电极液完成扩散，避免如K离子等，对周围的神经元产生影响。交换完成的电极液使电极能够记录负的膜电位和发放模式，而这类模式是神经细胞成熟程度的重要标志。记录膜电位的记录方式能记录的是全细胞的电流，通过这种方式可以间接了解电压门控的Na离子和K离子电流。另外，用这种方式保持膜电压在-60至-80mV数分钟，可以记录突触自发产生的膜电流。由于电极液中有大量的Cl离子，在该电压下，谷氨酸能GABA将触发突触后膜的负电位（EGlu约为0mV，ECl约为-38mV）。根据要记录的电流种类的不同，也应采用不同的电极液的组分。比如，以Cl离子为主要的阴离子的溶液，能够很好的记录GABAa受体导致的突触后电流，而对微弱的兴奋性突触后电流（EPSCs）的记录中，常常用到含有葡糖酸盐和甲基磺酸盐的溶液。
（6）在记录的最后阶段，转换到荧光镜下，观察并记录荧光的“回流”现象。转换的过程必须轻柔，避免碰断电极。