神经系统免疫性疾病模型制作实验1

神经系统自身免疫性疾病是以自体免疫细胞、免疫分子等攻击神经系统为主要病理机制的自身免疫性疾病，可发生在中枢神经系统、周围神经系统及神经－肌肉接头处，导致神经元或轴索损伤、髓鞘脱失、神经－肌肉接头破坏等病理改变。在中枢神经系统以多发性硬化(MS)、视神经脊髓炎(NMO)为代表。在周围神经系统以急性炎性脱髓鞘性多发性神经病(AIDP),如格林－巴利综合征(CBS)为代表。神经－肌肉接头病变以重症肌无力(MG)为代表。

相应的动物模型已经建立。如MS的动物模型为实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE),MG的动物模型为实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG)和CBS的动物模型为实验性自身免疫性神经炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)。根据模型诱导方案的不同，神经系统免疫性疾病动物模型可以分为主动免疫、被动转移和病毒感染三类。其中主动免疫模型被应用的最为广泛，也最能反映疾病的发生发展过程。被动转移模型是采取已发生疾病的动物外周血或淋巴结淋巴细胞被动注射给同品系健康动物，而导致其发病。虽然被动转移产生的动物模型在病理上和相应疾病类似，但是由于其产生过程、发展进程和疾病不同，因此主要用在探索EAE和MS的机制上。

实验动物Lewis大鼠6-8周龄体重200-250g

免疫原MOG35-55片段其氨基酸序列为MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

(1)免疫原的制备MOG35-55片段，其氨基酸序列为MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,由公司合成(2)免疫方案包括：①第一次免疫(Od)异氟醚吸入麻醉下，MOG35-55:FCA(1:1)混合液4ml,百日咳杆菌菌液：PBS(1:50)混合液0.2ml于足垫处皮下注射；②第二次免疫(7d) 异氟醚吸入麻醉下，MOG35-55:FCA(1:1)混合液4ml,百日咳杆菌菌液:PBS(1:50)混合液0.2ml于肋下皮下两侧皮下注射。

结果判读：成功模型的动物可出现体重下降、食量减少、肢体瘫痪、大小便失禁甚至死亡。形态学检查可见到中枢神经系统内不同程度的炎性细胞浸润和脱髓鞘，部分动物可同时合并轴突变性。存活者常在注射抗原后3周左右症状自行缓解，1月左右基本恢复。随症状缓解，体重也逐渐恢复。

(1)Pluchino评分法通常使用Pluchino的方法进行评定，标准如下：①1级部分尾巴下垂；②2级完全尾巴下垂；③3级完全尾巴下垂和站立行走缓慢；④4级后肢部分瘫痪；⑤5级后肢完全瘫痪；⑥6级濒死状态。

(2)取材Lewis大鼠由10%水合氯醛腹腔麻醉后，左侧臀部剪毛、消毒，分离出脑和脊髓，4%甲醒固定，纵向包埋，常规石蜡切片。

(3)染色与观察苏木精－伊红染色观察Lewis大鼠脑和脊髓神经组织切片淋巴细胞、巨噬细胞等炎性细胞的浸润情况。可见脊膜及中央管周围有明显的淋巴样组织浸润、增厚，脊髓白质内有细胞浸润的小灶状病变及静脉周围呈套袖样浸润。神经细胞有坏死，细胞核消失呈匀质小体，或细胞体消失留下一空隙，以及细胞周围有圆细胞浸润等。在脑组织中可见到脑膜增厚，淋巴样细胞及单核细胞浸润。室管膜及脉络膜亦呈同样变化。小静脉及毛细血管周围，则呈套袖状细胞浸润。脑实质内有小胶质细胞组成的浸润灶。有些星状细胞呈核碎裂、胞浆苍臼、细胞变形等。LuxolBlue髓鞘染色法观察Lewis大鼠脑和脊髓神经组织切片髓鞘脱失程度。

(1)动物选择不同种属动物对EAE敏感性不同，因而EAE的建立与选择的动物种属关系很大。经免疫遗传研究发现EAE的发生受遗传因素制约，EAE的易感性受免疫反应基因影响，它直接控制实验动物对抗原刺激的免疫反应。因此，在选择动物时需要寻找EAE模型的敏感动物，如SJL/J、BIOPL小鼠、Lewis大鼠、豚鼠、日本大耳白兔、新西兰白兔、恒河猴和食蟹猴等都是良好的EAE敏感动物。

(2)抗原的种类、选择和制备EAE的致脑炎抗原具有器官特异性，而没有种属特异性，存在所有温血动物中枢神经系统的白质内。从始至今使用的致脑炎抗原的种类有同种型、异种型或同种异型温血动物的全脑、脊髓组织匀浆或其中的白质，髓鞘蛋白脂蛋白，髓鞘碱性蛋白，用消化酶分解后的肤片，大脑内皮细胞膜以及MBP特异性T淋巴细胞。通常不同品种动物对同一抗原的敏感性不同、不同抗原的抗原性也不同，并且不同来源的同一抗原的活性也有明显差异。一般情况下，抗原性强弱依次为豚鼠脊髓＞大鼠脊髓＞牛脊髓，脊髓组织＞脑组织，豚鼠MBP>牛MBP。目前最被广泛接受的是使用MOG35-55片段，其氨基酸序列为MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK。MOG在髓鞘蛋白中含量很少，只占总髓鞘蛋白成分的0.01%-0.05%,但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细胞的最外层，故具高度免疫原性。因此，研究MOG诱导的EAE模型可以为更好的阐明MS的发病机制提供重要信息。近年来，用MOG诱导EAE逐渐成为国际上研究MS的主要模型。

(3)致敏方法致脑炎抗原的免疫途径有多种，如皮下、皮内、肌肉、腹腔和静脉注射。其中皮下多部位注射致脑炎抗原诱发EAE的发生率最高，因而常用的注射途径是皮下注射。EAE的产生不仅与实验动物和致脑炎抗原有关外，而且与致敏方法密切相关。由于致敏方法的不同，可诱导产生超急性、急性和慢性病程的EAE。具体实施方案如下：

①若给实验动物一次注射大剂量致敏原和CFA,同时注射百日咳菌苗，动物免疫后7-8d发病，这就是超急性EAE;

②若给实验动物一次注射较大剂量的致敏原和CFA,动物在注射后2周左右发病，这就是急性EAE;

③若给实验动物间隔一周注射较小剂量的致敏原和CFA,急性起病后有缓解复发的病程，或急性EAE经不当治疗也可有缓解复发，这些均是慢性复发性EAE。